Summary
Les données publiées concernant les concentrations de peptides liés au gène de la calcitonine (CGRP) dans le plasma humain sont incohérentes. Ces incohérences peuvent être dues à l’absence d’une méthodologie standardisée et validée pour quantifier ce neuropeptide. Ici, nous décrivons un protocole validé de dosage immuno-enzymatique (ELISA) pour purifier et quantifier le CGRP dans le plasma humain.
Abstract
Le peptide lié au gène de la calcitonine (CGRP) est un neuropeptide vasoactif qui joue un rôle putatif dans la physiopathologie des migraines et peut être candidat au statut de biomarqueur. Le CGRP est libéré des fibres neuronales lors de l’activation et induit une inflammation neurogène stérile et une vasodilatation artérielle dans le système vasculaire qui reçoit l’innervation efférente du trijumeau. La présence de CGRP dans le système vasculaire périphérique a incité les recherches pour détecter et quantifier ce neuropeptide dans le plasma humain à l’aide de tests protéomiques, tels que le test immuno-enzymatique (ELISA). Cependant, sa demi-vie de 6,9 minutes et la variabilité des détails techniques des protocoles d’essai, qui ne sont souvent pas entièrement décrits, ont donné des données ELISA CGRP incohérentes dans la littérature. Ici, un protocole ELISA modifié pour la purification et la quantification du CGRP dans le plasma humain est présenté. Les étapes de la procédure comprennent la collecte et la préparation des échantillons, l’extraction à l’aide d’un sorbant polaire comme moyen de purification, des étapes supplémentaires pour bloquer la liaison non spécifique et la quantification via ELISA. De plus, le protocole a été validé avec des pics et des expériences de récupération et de linéarité des expériences de dilution. Ce protocole validé peut théoriquement être utilisé pour quantifier les concentrations de CGRP dans le plasma des personnes souffrant non seulement de migraine, mais aussi d’autres maladies dans lesquelles le CGRP peut jouer un rôle.
Introduction
Le peptide lié au gène de la calcitonine (CGRP) est un neuropeptide de 37 acides aminés présent dans les fibres neuronales avec localisation périvasculaire ainsi que dans les tissus non neuronaux. Les deux formes de CGRP, α- et β-CGRP, partagent plus de 90% d’homologie et partagent des fonctions physiologiques; cependant, l’αCGRP se trouve dans le système nerveux central et périphérique, tandis que le βCGRP se trouve dans le système nerveux entérique 1,2. Lors de l’activation des nocicepteurs et de l’exocytose dépendante du calcium, le CGRP est libéré par les neurones, induisant une inflammation neurogène stérile impliquant une vasodilatation artérielle et une extravasation des protéines plasmatiques 3,4,5,6,7. À partir de là, le CGRP apparaît dans les vaisseaux postcapillaires et peut être un biomarqueur de maladies qui provoquent une activation nociceptive afférente, telles que la migraine 8,9,10,11. Il convient de noter que le CGRP a également été impliqué dans la COVID-19 en raison de son rôle dans l’angiogenèse et la modulation immunitaire, et peut prédire une évolution défavorable de la maladie12,13. Ainsi, un protocole pour la quantification précise du CGRP dans le plasma humain pourrait avoir une grande valeur.
La plus grande attention a peut-être été accordée au rôle du CGRP dans la migraine. Sur la base d’études précliniques et cliniques, le CGRP a été proposé comme biomarqueur possible de la migraine et comme cible pour le traitement 3,4,5,6,7,8,9,10. Certaines études ont révélé une élévation du CGRP dans les cohortes souffrant de migraine épisodique par rapport aux participants témoins10,14,15. Le succès des inhibiteurs du CGRP dans les essais cliniques pour le traitement de la migraine semble impliquer un CGRP élevé comme facteur causal des migraines. Cependant, tous les chercheurs n’ont pas corroboré ces résultats16,17,18,19. De plus, le rôle du CGRP dans les symptômes de migraine autres que les maux de tête n’a pas encore été élucidé; les travaux actuels ont été motivés par le désir de comprendre le rôle du CGRP dans les symptômes vestibulaires de la migraine.
L’incohérence des données des essais immunologiques du CGRP dans la littérature pourrait être due à plusieurs raisons. Premièrement, la demi-vie du CGRP dans le système vasculaire périphérique est de 6,9 min 20, en raison de l’activité des sérines protéases 21, des enzymes dégradant l’insuline et autres métalloprotéases 22, des endopeptidases neutres 23 et de l’enzyme de conversion de l’endothéline-1 24. Deuxièmement, les détails techniques variables des immunoessais utilisés pour quantifier le CGRP ne sont pas entièrement décrits dans ces études. Enfin, le manque de standardisation de la méthodologie des immunoessais complique encore plus le tableau.
Cet article décrit un protocole ELISA (Modified Enzyme-linked immunosorbent assay) qui permet la purification et la quantification précise des α et βCGRP dans le plasma humain. Les anticorps du kit ne sont pas réactifs avec l’amyline, la calcitonine ou la substance P. Ce protocole a subi les expériences de validation nécessaires, telles que le pic et la récupération et la linéarité de la dilution, dont les données sont présentées ici. Un tel protocole ELISA du CGRP qui a fait l’objet d’une validation n’a pas encore été entièrement décrit dans la littérature. Ce protocole peut être utilisé pour quantifier le CGRP dans le plasma humain dans le contexte de la migraine ainsi que cardiologique2,25, dermatologique26, obstétrical 27, rhumatologique28,29, musculo-squelettique 30,31, endocrinien 32,33, et les maladies virales 12,13 dans lesquelles le CGRP a été impliqué.
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Protocol
Ce protocole a été élaboré à partir d’échantillons de plasma humain provenant de personnes consentantes avec l’approbation du Johns Hopkins Institutional Review Board (NA_00092491).
1. Prélèvement et préparation des échantillons
- Prélever 5 mL de sang total dans la veine antécubital au moyen de méthodes de ponction veineusestandard 34 dans un tube de collecte d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) vacutainer de 6 mL.
- Ajouter 0,5 mL d’inhibiteur de la sérine protéase compétitive d’aprotinine (10 000 KIU/mL) dans le tube après la collecte pour bloquer la lyse du peptide cible. Retourner le tube 10 fois pour permettre à l’aprotinine de se mélanger adéquatement avec le sang. Ensuite, rangez les tubes sur de la glace jusqu’à l’étape suivante.
- Centrifuger le tube à 604 x g pendant 4 min à 4 °C dans les 60 minutes suivant le prélèvement sanguin.
- Prélever la fraction plasmatique à l’aide d’une pipette et transférer dans des cryoflacons stériles à fond rond de 2 mL.
- Conservez immédiatement les cryoflacons à -80 °C jusqu’à 2 semaines.
2. Extraction des échantillons de plasma
- Placer une cartouche d’extraction à l’intérieur d’un tube centrifuge conique de 15 mL avec les arêtes extérieures de la cartouche soutenues par les crêtes extérieures du tube.
- Activez la cartouche en faisant d’abord passer 5 mL de méthanol à 100 %, puis 10 mL d’eau ultrapure à travers la cartouche.
- Au fur et à mesure que le fluide passe à travers la cartouche par un flux gravitaire, il s’accumule dans le tube.
- Jetez l’excès de liquide au fur et à mesure qu’il s’accumule pour vous assurer que le liquide n’engloutit pas la cartouche.
- Assurez-vous que la cartouche ne sèche pas au cours de l’expérience.
- Diluer 250 μL de plasma avec 750 μL d’acide acétique à 4%.
- Passez lentement la solution de plasma et d’acide acétique de 1 mL dans la cartouche.
REMARQUE: Cette étape devrait prendre environ 30 s via un flux entraîné par gravité pour chaque millilitre passé. - Lavez la cartouche avec 10 ml d’acide acétique à 4 %. Comme indiqué précédemment, jetez l’excès de liquide au fur et à mesure qu’il s’accumule pour vous assurer que le liquide n’engloutit pas la cartouche.
- Une fois que la dernière goutte d’acide acétique est libérée de la cartouche, retirez la cartouche du tube et placez-la dans un nouveau tube à centrifuger conique de 15 mL.
- Préparer une solution 10:1 de méthanol à 100 % et d’acide acétique à 4 % en mélangeant 2,7 mL d’acide acétique à 4 % et 0,3 mL de méthanol à 100 %. Utilisez cette solution pour éluer le CGRP en faisant passer cette solution dans la cartouche 1 mL à la fois. Faites une pause de 25 minutes entre chaque millilitre de solution passé. Ne jetez PAS l’éluant.
- Le tube contiendra 3 mL du fluide élué 25 min après le passage du dernier millilitre de la solution de méthanol et d’acide acétique. Placer chaque 1 mL d’éluant dans un tube microcentrifuge de 1,7 mL.
REMARQUE: Cela devrait donner trois tubes de microcentrifugation de chaque cartouche. - Placez chaque tube dans une mini-centrifugeuse pendant 1 s pour vous assurer que tout l’éluant est au fond de chaque tube.
- Sécher tous les échantillons par centrifugation sous vide à 4 °C (réglé sur la fonction concentrateur, pour les solutions aqueuses, à 1 400 tr/min ; la force g varie en fonction de la position des tubes et varie donc de 130 à 250 x g).
REMARQUE : Le temps nécessaire à la centrifugeuse sous vide pour sécher les échantillons dépendra du type de tube microcentrifuge utilisé. - Immédiatement avant de passer à la procédure d’analyse (étape 4.1), reconstituer l’échantillon préalablement séché avec un tampon de dosage immunoenzymatique (EIA) (voir le tableau des matières) décongelé à température ambiante (RT) ou à 20 °C.
REMARQUE : Le volume de tampon d’AIE utilisé pour reconstituer l’échantillon séché doit être égal au volume d’échantillon original, soit 250 μL.
3. Préparation de la plaque ELISA - blocage pour limiter la liaison non spécifique
- Ajouter 250 μL de tampon de sérum physiologique tris (TBS)/tampon bloquant la gélatine de poisson à chaque puits de la plaque.
- Placer une feuille de couverture sur la plaque et incuber pendant 2 h à TA.
- Retirez la feuille de couverture et videz la plaque par inversion ou aspiration à l’aide d’une pipette multicanal. Ensuite, épongez l’assiette sur une serviette en papier pour éliminer toute trace de liquide.
- Sécher la plaque en la laissant dans une hotte à flux laminaire pendant 10 min.
- Une fois la plaque visiblement sèche, placez-la dans un sachet en aluminium scellé avec un sachet déshydratant en gel de silice et conservez le sachet à -20 °C pendant 24 h.
NOTE: Les plaques doivent être utilisées dans les 4 semaines suivant l’incubation de la plaque.
4. Avant la procédure d’essai
- Préparez les réactifs (tampon EIA, norme CGRP, contrôle qualité CGRP, traceur CGRP, tampon de lavage) conformément aux instructions du kit. Préparez le réactif d’Ellman seulement après la fin de la période d’incubation de 16 à 20 heures.
- Décongeler tous les échantillons et les réactifs à TA avant d’effectuer le reste du protocole.
5. Procédure de dosage
- Rincer cinq fois chaque puits dans la plaque bloquée à l’aide d’un tampon de lavage fourni en kit (300 μL/puits). Pour chaque rinçage, faire une pause de 30 s après avoir placé le tampon de lavage dans les puits, puis jeter le liquide ou aspirer à l’aide d’une pipette multicanal.
- Après le rinçage final, retirer tout le tampon des puits par inversion (inversion de la plaque pour expulser le liquide à l’intérieur des puits) ou aspiration à l’aide d’une pipette multicanaux. Épongez les dernières gouttes sur une serviette en papier et tapotez la plaque inversée jusqu’à ce que tout le liquide soit visiblement retiré des puits.
- Mettez de côté au moins deux puits sans réactifs ni tampons appelés puits « vierges ». Ensuite, réserver au moins deux autres puits pour la liaison non spécifique (NSB).
- Distribuer 100 μL de tampon EIA dans chaque puits NSB.
- Distribuer 100 μL des étalons du PRMC en double dans les puits appropriés.
- Distribuer 100 μL d’échantillons (reconstitués dans un tampon EIA) et le contrôle de la qualité en double dans des puits appropriés.
- Distribuer 100 μL de traceur CGRP (anticorps anti-CGRP attaché à l’acétylcholinestérase) à chaque puits contenant NSB, normes CGRP, échantillons et contrôle de la qualité. Ne distribuez pas de traceur aux puits « vierges ».
- Couvrir la plaque à l’aide d’une feuille de couverture transparente, en scellant chaque puits de manière à ce que les échantillons et les réactifs de chaque puits ne s’évaporent pas de manière significative. Incuber la plaque pendant 16-20 h à 4 °C.
- Une fois l’incubation terminée, reconstituer le réactif d’Ellman conformément aux instructions du kit.
- Retourner la plaque pour enlever tout liquide. Rincer chaque puits (comme décrit ci-dessus) trois fois avec 300 μL de tampon de lavage.
- Après le troisième rinçage, retirer le liquide des plaques, placer la plaque sur une plaque vibrante et agiter à 120 tr/min pendant 2 min.
- Lavez l’assiette trois fois de plus. Après le rinçage final, retirer tout le tampon des puits par inversion ou aspiration à l’aide d’une pipette multicanal. Épongez les dernières gouttes de liquide sur une serviette en papier et tapotez la plaque inversée jusqu’à ce que tout le liquide soit visiblement retiré des puits.
REMARQUE : Les trois lavages supplémentaires décrits à cette étape peuvent ne pas être nécessaires si vous utilisez une laveuse de microplaques ELISA. - Distribuer 200 μL de réactif d’Ellman dans chaque puits (sans compter les puits « Blank »).
- Couvrez la plaque avec une nouvelle feuille de couverture et enveloppez-la dans du papier d’aluminium pour éviter toute exposition à la lumière. Incuber dans le noir à TA pendant 1 h.
- Assurez-vous qu’il n’y a pas de liquide à l’arrière de la plaque qui pourrait confondre la lecture du spectrophotomètre en essuyant l’arrière avec une serviette en papier sèche.
- Lire la plaque pour l’absorbance à 405 nm (couleur jaune).
6. Analyse des données
- Calculez l’absorbance moyenne pour chaque « blanc », NSB, étalon, contrôle de qualité et échantillons.
- Soustrayez les valeurs d’absorbance moyennes NSB des valeurs d’absorbance standard, de contrôle de la qualité et d’absorbance de l’échantillon.
- Tracer l’absorbance sur l’axe des y et la concentration sur l’axe des abscisses. Construisez une courbe standard à l’aide d’un modèle de régression logistique à quatre paramètres.
- Une fois la courbe construite, utilisez l’équation de la courbe pour déterminer les concentrations interpolées pour le contrôle de la qualité et les échantillons, qui peuvent être lues sur l’axe des abscisses.
NOTA : La courbe standard n’est validée que si la concentration interpolée calculée pour le contrôle de la qualité se situe à moins de 25 % de la concentration prévue (habituellement 125 pg/mL, mais voir l’étiquette du flacon de contrôle de la qualité).
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Representative Results
Plusieurs étapes clés du protocole doivent être soulignées. Tout d’abord, l’aprotinine, un inhibiteur de la sérine protéase, doit être ajoutée aux échantillons de sang total immédiatement après le prélèvement pour empêcher une dégradation enzymatique supplémentaire du CGRP. Il a été démontré que les protéases à sérine jouent un rôle dans le métabolisme du CGRP, et une étude antérieure a également utilisé l’aprotinine pour quantifier le CGRP chez l’homme21,35. Si les inhibiteurs de la protéase ne sont pas utilisés et que la préparation de l’échantillon prend plus de 60 minutes, on peut s’attendre à une diminution des niveaux de CGRP lors de l’exécution de l’ELISA. Deuxièmement, l’extraction en phase solide avant ELISA concentre le CGRP dans l’éluant et élimine les molécules potentiellement interférentes de la matrice plasmatique. Cette étape d’extraction augmente le rendement du CGRP dans les expériences de pointe et de récupération (voir plus en détail dans la section suivante). La centrifugation sous vide en chambre froide après extraction limite encore la perte de CGRP. Troisièmement, avant l’ELISA, les plaques de microtitrage doivent être bloquées à l’aide d’un tampon de blocage. Cela permet l’adsorption passive de protéines non spécifiques dans le tampon aux sites de liaison restants dans les plaques, réduisant ainsi le signal de fond. Le blocage contribue à réduire les rendements irréalistes du CGRP.
Les expériences de pointe et de récupération déterminent si la détection du CGRP est affectée par les différences entre le diluant de courbe standard (ici, tampon EIA) et la matrice expérimentale d’échantillons (ici, plasma). Le plasma et/ou le sérum peuvent contenir des molécules qui bloquent la liaison des anticorps au CGRP ou dégradent le peptide, interférant ainsi avec la capacité du test à détecter et à quantifier la concentration initiale de CGRP avec précision. À cette fin, nous avons ajouté des quantités connues de CGRP aux échantillons de plasma - l’étape de « pointe » - et calculé la quantité de CGRP « récupérée » après l’extraction et l’ELISA. Le stock CGRP a été obtenu auprès du fabricant et stocké dans un congélateur à -20 °C jusqu’à utilisation.
Dans la linéarité des essais de dilution, un échantillon est dilué en série et des concentrations de CGRP sont calculées pour chaque dilution. Si les échantillons dilués ne présentent pas de diminutions linéaires appropriées de la concentration de CGRP, cela indiquerait que le tampon ou le plasma de l’EIA interfère avec la détection du CGRP à certaines concentrations ou que la courbe standard n’est pas précise dans la plage touchée. Lors de l’expérience de pointe et de récupération décrite ci-dessus, nous avons dilué en série les échantillons « enrichis » ; nous avons augmenté un échantillon de plasma pour donner une concentration de CGRP de 200 pg / mL et ensuite dilué l’échantillon à 100 pg / mL, puis à 50 pg / mL.
Les échantillons de plasma de trois participants sans antécédents cardiovasculaires, respiratoires ou récents de céphalées ou de symptômes neurologiques ont été enrichis de différentes concentrations de CGRP. Le protocole a été exécuté pour ces échantillons, en plus des échantillons témoins non enrichis. La figure 1 montre un exemple de carte de plaque pour les pics et la récupération et la linéarité des expériences de dilution. Un ajustement logistique à quatre paramètres a été effectué pour créer une courbe standard qui permettait un ajustement au-delà de la plage linéaire (tableau 1 et figure 2). Les taux de récupération ont été calculés pour chaque échantillon enrichi et se situaient dans la plage acceptable (tableau 2). La linéarité de la dilution a été démontrée dans les échantillons enrichis (figure 3). Le tableau 3 montre les résultats obtenus à partir d’une expérience infructueuse de pointe et de récupération réalisée conformément aux instructions du fabricant et avant l’inclusion des étapes supplémentaires pour bloquer la fixation non spécifique. Ces données montrent des taux de récupération supérieurs à la limite supérieure de 125%, indiquant la présence d’une consolidation non spécifique. Après avoir ajouté les étapes du protocole pour bloquer la plaque à l’aide d’un tampon de blocage (étapes 3.1-3.5), nous avons pu réduire cet effet et atteindre des valeurs de récupération acceptables (tableau 2). Chez trois patients sans migraine ni symptômes vestibulaires, nous avons constaté que la concentration moyenne de CGRP dans le plasma était de 1,68 ± 0,13 pg / mL. Les expériences futures devraient viser à utiliser la méthodologie actuelle à plus grande échelle de patients témoins.
Figure 1 : Exemple de carte de plaque. Chaque plaque doit contenir des étalons, des échantillons, des blancs et des puits NSB, tous en double ou en triplicate. Les puits blancs ne doivent pas contenir de liquide, et les puits NSB doivent contenir un tampon immunologique enzymatique exclusif, un anticorps secondaire lié à une enzyme et le réactif d’Ellman. Les valeurs d’absorbance moyennes pour les puits NSB doivent être soustraites des valeurs d’absorbance de l’étalon avant de créer la courbe standard. Les valeurs d’absorbance moyennes pour les puits NSB doivent également être soustraites des valeurs d’absorbance des échantillons, avant de calculer le pourcentage de récupération. Il n’y a pas d’effet de la position de la plaque. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Exemple de courbe standard de régression logistique à quatre paramètres (4PL). Cette courbe standard est mathématiquement décrite par une équation sous une forme similaire à celle du tableau 1. Une courbe de régression 4PL est plus adaptée aux systèmes biologiques que les courbes linéaires. Cette courbe et cette équation sont utilisées pour interpoler les contrôles de qualité et les échantillons sur la même plaque sur laquelle la norme a été créée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Diagraphie linéaire de linéarité de dilution montrant des échantillons dopés à 200 pg/mL, puis dilués en série 1:2 et 1:4. Ces données démontrent la linéarité sur une large gamme de dilutions, ce qui indique que la méthode d’essai est précise pour une large gamme de concentrations de CGRP. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Paramètre | Valeur |
| X50 | 294.75 |
| Équation |  |
| Forme d’équation |  |
Tableau 1 : Exemple d’équation de courbe standard de régression logistique à quatre paramètres (4PL) avec des titres X50. Une courbe de régression 4PL tient compte de la complexité observée dans les systèmes biologiques. Cette courbe a été utilisée pour analyser les résultats de l’ELISA, car elle est plus appropriée que la régression linéaire.
| Absorbance (OD) | Concentration interpolée (pg/mL) | Rendement en pourcentage | |
| Contrôle sans pointe | -0.0434 | Ne tombe pas sur la courbe (c.-à-d. ~0) | |
| Augmenté à 200 pg/mL | 0.2712 | 214,7 ± 23,4 | 107.40% |
| Augmenté à 100 pg/mL | 0.0966 | 102,7 ± 2,35 | 102.70% |
| Augmenté à 50 pg/mL | 0.0205 | 55,1 ± 12,65 | 110.20% |
Tableau 2 : Résultats d’une expérience réussie de pointe et de récupération de trois participants témoins en raison d’un manque d’extraction en phase solide et de blocage des plaques. Le pourcentage de rendement pour les échantillons enrichis se situait tous à moins de 20 % du rendement idéal de 100 %, ce qui indique que la détection du CGRP n’est pas affectée par la matrice expérimentale d’échantillons de plasma.
| Absorbance (OD) | Concentration interpolée (pg/mL) | Rendement en pourcentage | |
| Contrôle sans pointe | -0.2087 | Ne tombe pas sur la courbe (c.-à-d. ~0) | |
| Augmenté à 200 pg/mL | 2.371 | 264,2 ± 104 | 132.10% |
| Augmenté à 100 pg/mL | 1.134 | 167,5 ± 31,2 | 167.50% |
| Augmenté à 50 pg/mL | 0.3218 | 80,55 ± 4,54 | 161.10% |
Tableau 3 : Résultats d’une expérience de pointe et de récupération infructueuse de trois participants témoins en raison d’un manque de blocage des plaques. Le pourcentage de rendement pour les échantillons enrichis est tombé bien au-dessus de la limite supérieure de rendement de 120%, ce qui indique que le test peut être corrompu par NSB. Après avoir obtenu ces résultats, nous avons ajouté les étapes 3.1-3.5 dans le protocole pour bloquer NSB sur la plaque avant le test.
| Absorbance (OD) | Concentration interpolée (pg/mL) | Rendement en pourcentage | |
| Contrôle sans pointe | 0.0401 | 12.93 | |
| Augmenté à 100 pg/mL | 0.0315 | 10 h 17±2,31 | 10.17% |
| Augmenté à 50 pg/mL | 0.0152 | 4.895±15.4 | 9.79% |
| Augmenté à 25 pg/mL | 0.0007 | 0,2177±6,43 | 0.87% |
Tableau 4 : Résultats d’une expérience infructueuse de pic et de récupération de trois participants témoins. Le pourcentage de rendement pour les échantillons enrichis est tombé bien en dessous de la limite inférieure de rendement de 80 %, ce qui indique qu’une optimisation supplémentaire était nécessaire pour faire face à d’éventuels processus de dégradation et de liaison concurrentiels. Ces résultats proviennent du test ELISA compétitif d’un autre fabricant, avec une limite inférieure de détection de 2,23 pg/mL, et un cv intra-essai < 10 % et un cv inter-essais < 12 %.
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Discussion
Cet article décrit un protocole validé permettant la détection et la quantification du CGRP dans le plasma humain. Ce protocole a été synthétisé après que les kits ELISA commerciaux du CGRP se sont avérés ne pas quantifier avec précision cette molécule. Après avoir établi un protocole de préparation des échantillons et une courbe standard valide, les pics et la récupération ainsi que la linéarité des expériences de dilution ont montré que le pourcentage de récupérations était beaucoup plus faible que prévu. Des résultats similaires ont été obtenus à l’aide d’une trousse ELISA commerciale différente du CGRP (tableau 4). À titre de référence, la récupération standard largement acceptée est de 80 à 120 %36. Ces résultats peuvent suggérer la présence d’une activité protéase dégradant CGRP21,22,23,24, d’autres molécules se liant au CGRP, limitant ainsi sa disponibilité pour la liaison aux anticorps de la plaque, ou la liaison compétitive de protéines non ciblées aux anticorps de la plaque.
Pour contrôler ces facteurs de confusion possibles, un protocole d’extraction a été optimisé pour purifier le plasma par extraction avec un sorbant exclusif avant ELISA. Ce sorbant isole ostensiblement les molécules polaires telles que le CGRP. Pour déterminer l’efficacité de l’extraction avant l’ELISA, des échantillons de plasma humain ont augmenté avec des concentrations connues de CGRP lorsque les témoins positifs ont subi une extraction, puis ELISA. Ces échantillons enrichis n’ont donné lieu qu’à ~50%-60% de récupération. Ces résultats indiquent que le CGRP ajouté de manière exogène n’est pas détecté dans le plasma, comme on pourrait s’y attendre.
Diverses autres étapes du protocole ont été optimisées : ajout d’un inhibiteur de la sérine protéase aux échantillons de sang total avant la centrifugation pour inhiber la dégradation21, abaissement de la température de la centrifugation sous vide après extraction et ajustement des méthodes de remise en suspension post-centrifugation. Une expérience de pointe et de récupération après ces changements a révélé des concentrations irréalistes de CGRP, soit un taux de récupération supérieur à 120 % (tableau 3). Il est rassurant de constater que des valeurs plus élevées que prévu ont également été rapportées récemment après l’extraction à l’aide d’un essai similaire de Messlinger et coll.37, ce qui indique que cela reste un problème. Messlinger et al. reconnaissent que le dosage après extraction plasmatique ne reproduit pas les concentrations réalistes de CGRP, sans fournir de raison pour ce phénomène37.
Nous avons émis l’hypothèse que la capacité de liaison résiduelle sur les plaques de microtitrage ELISA provoquant une liaison non spécifique pourrait être responsable des taux de récupération élevés. Avant ELISA, la plaque était incubée avec un tampon de blocage, TBS / tampon de gélatine de poisson, pour réduire cette capacité de liaison. Cette étape supplémentaire a permis d’obtenir des taux de récupération plus appropriés (tableau 2). Ainsi, les modifications et optimisations discutées ci-dessus, y compris l’utilisation du tampon bloquant, restent des étapes critiques dans le protocole. Ces étapes ont permis d’obtenir une limite de détection inférieure de 1,05 pg/mL, comparativement à celle de la trousse originale du fabricant indiquée à 2 pg/mL.
En ce qui concerne le dépannage, l’étape 2.10 nécessite une centrifugation sous vide pour sécher l’éluant. On a observé que la longueur de cette étape variait en fonction du type de tube microcentrifuge dans lequel se trouvent les échantillons. En utilisant les tubes microcentrifugeuses décrits dans le tableau des matériaux, cette étape dure généralement 5 heures. Cependant, lorsque d’autres tubes microcentrifuges de plus grands volumes sont utilisés, cette étape peut durer jusqu’à 11 h. Une alternative à la centrifugation sous vide peut être la lyophilisation ou la lyophilisation des échantillons, ce qui nécessiterait que les échantillons soient congelés après l’extraction. Cependant, la lyophilisation n’a pas été testée dans la construction de ce protocole. De plus, si des concentrations de CGRP systématiquement inférieures aux attentes sont trouvées, il faut s’assurer que tous les réactifs, en particulier les anticorps, sont décongelés à température ambiante avant utilisation. L’instabilité des réactifs, tels que les solutions d’anticorps et de traceurs, pourrait contribuer à une erreur systématique de liaison au CGRP. Si le rendement reste insuffisant, la liaison des anticorps au CGRP peut être affectée par l’acidité relative de l’éluant (solution de méthanol et d’acide acétique), malgré une reconstitution avec un tampon. Dans ce cas, une étape de rectification du pH serait un ajout logique après reconstitution avec tampon.
Les limites de ce protocole comprennent les limites associées à toute méthodologie ELISA, en particulier l’instabilité des anticorps38. Les réactifs d’anticorps doivent être décongelés à température ambiante avant d’être utilisés dans le dosage; cependant, un réchauffement prolongé peut entraîner une dénaturation et, par conséquent, une diminution de l’efficacité de la liaison du CGRP. De plus, le CGRP peut subir une dégradation par une variété de protéases non sérines, ce qui entraîne une augmentation des résultats faussement négatifs. Bien que ce protocole limite la dégradation en ajoutant une sérine protéase et en limitant le temps de traitement de l’échantillon à moins de 60 minutes, la dégradation peut encore se produire. Une autre limite est l’absence de cycles de gel-dégel testés. Lee et coll.39 ont démontré que les cycles de gel-dégel peuvent augmenter ou diminuer les quantités de protéines sériques et plasmatiques, selon la sensibilité de la protéine. La sensibilité du CGRP aux cycles de gel-dégel n’a pas été entièrement testée dans la littérature, bien que Messlinger et coll. aient noté que les niveaux de CGRP diminuent lors d’un cycle de congélation et de décongélation37. En outre, le rendement de ce protocole peut bénéficier de l’utilisation de tubes LoBind protéiques, conçus avec une surface hydrophile, conduisant ainsi à une meilleure récupération des protéines.
Nous notons que ces expériences de validation ne semblent pas avoir été réalisées par les auteurs d’études récentes quantifiant le CGRP dans le plasma humain 16,18,35,40,41. Un examen de la méthodologie ELISA par Messlinger et coll.37 souligne la nécessité de tels contrôles et remet en question les études qui ne les ont pas utilisés. Nous croyons que notre travail de validation et de normalisation d’un protocole permettra de mieux ancrer les recherches futures sur le PRMC. Les implications d’un tel protocole sont vastes et peuvent théoriquement être étendues à l’étude du statut des biomarqueurs du CGRP dans les processus pathologiques et non neurologiques 2,25,26,27,28,29,30,31,32,33.
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Disclosures
Les auteurs n’ont pas d’autres divulgations à ajouter.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Robert N. Cole, Lauren R. DeVine et Marcos Iglesias pour leurs discussions utiles concernant ce protocole. Cela a été financé en partie par le financement de l’American Otological Society (Fellowship Grant, PSK), de l’American Hearing Research Foundation (90066548/90072266, JPC) et du National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS), une composante des National Institutes of Health (NIH), et du NIH Roadmap for Medical Research (UL1 TR003098, NSF). Le contenu de la publication relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement le point de vue officiel du TPIR Johns Hopkins, du NCATS ou des NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL Safeseal microcentrifuge tube | Sorenson Bioscience, Inc. | 11510 | |
| 99% methanol | ThermoFisher Scientific | L13255.0F | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 14-959-49B | |
| 2 mL round bottom sterile cryovials | CRYO.S | 122263 | |
| 4% acetic acid | ThermoFisher Scientific | 035572.K2 | |
| 6.0 mL Vacutainer EDTA collection tube | BD | 367863 | |
| Allegra 64R benchtop centrifuge | Beckman Coulter, Inc. | 367586 | |
| Aprotinin | VWR | 76344-814 | |
| CGRP (human) ELISA kit | Bertin Bioreagent | A05481 | |
| CGRP stock | Bertin Bioreagent | ||
| EIA Buffer | Bertin Bioreagent | A07000 | |
| Ellman's Reagent | Bertin Bioreagent | A09000_49+1 | |
| Multichannel pipettes | ThermoFisher Scientific | 4661180N | |
| Oasis HLB 3 cc Vac Cartridges | Waters | WAT094226 | |
| Orbital Shaker | Bellco | 7744-01010 | |
| Precision micropipettes | ThermoFisher Scientific | F144055MG | |
| SpectraMax M Series Multi-Mode Microplate reader | Molecular Devices | Part Number M2 | |
| TBS/Fish Gelatin | Bioworld, from Fischer Scientific | 50-199-167 | |
| Ultrapure water ELISA Grade | Bertin Bioreagent | A07001 | |
| Vacufuge plus - Centrifuge Concentrator | Eppendorf | 22820109 | |
| Wash Buffer | Bertin Bioreagent | A17000 |
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