Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Een protocol voor het evalueren en kwantificeren van retinale gepigmenteerde epitheelpathologieën in muismodellen van leeftijdsgebonden maculaire degeneratie

Published: March 10, 2023 doi: 10.3791/64927
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 1,2, 3,4, 1,2
1Department of Medical Genetics, University of Wisconsin-Madison, 2McPherson Eye Research Institute, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Ophthalmology, Duke University, 4Department of Cell Biology, Duke University

Summary

Muismodellen kunnen nuttige hulpmiddelen zijn voor het onderzoeken van de biologie van het retinale gepigmenteerde epitheel (RPE). Er is vastgesteld dat muizen een reeks RPE-pathologieën kunnen ontwikkelen. Hier beschrijven we een fenotyperingsprotocol om RPE-pathologieën bij muizen op te helderen en te kwantificeren met behulp van licht, transmissie-elektron en confocale microscopie.

Abstract

Leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD) is een slopende retinale aandoening bij vergrijzende populaties. Er wordt algemeen aangenomen dat disfunctie van het retinale gepigmenteerde epitheel (RPE) een belangrijke pathobiologische gebeurtenis is bij AMD. Om de mechanismen te begrijpen die leiden tot RPE-disfunctie, kunnen muismodellen door onderzoekers worden gebruikt. Uit eerdere studies is gebleken dat muizen RPE-pathologieën kunnen ontwikkelen, waarvan sommige worden waargenomen in de ogen van personen met de diagnose AMD. Hier beschrijven we een fenotyperingsprotocol om RPE-pathologieën bij muizen te beoordelen. Dit protocol omvat de voorbereiding en evaluatie van retinale doorsneden met behulp van lichtmicroscopie en transmissie-elektronenmicroscopie, evenals die van RPE flat mounts door confocale microscopie. We beschrijven de veel voorkomende soorten muizen RPE-pathologieën die door deze technieken worden waargenomen en manieren om ze te kwantificeren door middel van onbevooroordeelde methoden voor statistische tests. Als proof of concept gebruiken we dit RPE-fenotyperingsprotocol om de RPE-pathologieën te kwantificeren die zijn waargenomen bij muizen die transmembraaneiwit 135 (Tmem135) overexpressie overexpressie en verouderde wildtype C57BL / 6J-muizen. Het belangrijkste doel van dit protocol is om standaard RPE-fenotyperingsmethoden te presenteren met onbevooroordeelde kwantitatieve beoordelingen voor wetenschappers die muismodellen van AMD gebruiken.

Introduction

Leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD) is een veel voorkomende blinderende ziekte die populaties ouder dan 55 jaar treft1. Veel onderzoekers geloven dat disfunctie binnen het retinale gepigmenteerde epitheel (RPE) een vroege en cruciale pathobiologische gebeurtenis is bij AMD2. De RPE is een monolaag van gepolariseerde cellen belast met het handhaven van de homeostase van naburige fotoreceptoren en choroïdale bloedvaten3. Er bestaan verschillende modellen om ziektegerelateerde mechanismen binnen de RPE te onderzoeken, waaronder celkweekmodellen4,5 en muizen 6,7,8. Een recent rapport heeft gestandaardiseerde protocollen en kwaliteitscontrolecriteria voor RPE-celcultuurmodellen4 beschreven, maar geen enkel rapport heeft geprobeerd de fenotypering van de RPE in muismodellen te standaardiseren. In feite missen veel publicaties over muismodellen van AMD een volledige beschrijving van de RPE of kwantificering van de RPE-pathologieën daarin. Het algemene doel van dit protocol is om standaard RPE-fenotyperingsmethoden te presenteren met onbevooroordeelde kwantitatieve beoordelingen voor wetenschappers die AMD-muismodellen gebruiken.

Eerdere publicaties hebben de aanwezigheid van verschillende RPE-pathologieën bij muizen opgemerkt door middel van drie beeldvormingstechnieken. Met lichtmicroscopie kunnen onderzoekers bijvoorbeeld de grove morfologie van het muizennetvlies bekijken (figuur 1A) en RPE-pathologieën detecteren, zoals RPE-verdunning, vacuolisatie en migratie. RPE-verdunning in een AMD-muismodel wordt geïllustreerd door een afwijking in de RPE-hoogte van hun respectieve bedieningselementen (figuur 1B). RPE-vacuolisatie kan worden onderverdeeld in twee afzonderlijke categorieën: microvacuolisatie (figuur 1C) en macrovacuolisatie (figuur 1D). RPE-microvacuolisatie wordt samengevat door de aanwezigheid van vacuolen in de RPE die de totale hoogte niet beïnvloeden, terwijl macrovacuolisatie wordt aangegeven door de aanwezigheid van vacuolen die uitsteken in de buitenste segmenten van de fotoreceptoren. RPE-migratie onderscheidt zich door het focale aggregaat van pigment boven de RPE-monolaag in een retinale doorsnede (figuur 1E). Opgemerkt moet worden dat migrerende RPE-cellen in AMD-donorogen immunoreactiviteit vertonen voor immuuncelmarkers, zoals cluster van differentiatie 68 (CD68)9, en immuuncellen kunnen vertegenwoordigen die RPE-puin overspoelen of RPE die transdifferentiatie ondergaat 9. Een andere beeldvormingstechniek genaamd transmissie-elektronenmicroscopie kan onderzoekers in staat stellen om de ultrastructuur van de RPE en zijn keldermembraan te visualiseren (figuur 2A). Deze techniek kan de overheersende sub-RPE-afzetting bij muizen identificeren, bekend als de basale laminaire afzetting (BLamD) (figuur 2B)10. Ten slotte kan confocale microscopie de structuur van RPE-cellen onthullen door middel van beeldvorming van RPE-flatmounts (figuur 3A). Deze methode kan RPE-dysmorfie blootleggen, de afwijking van de RPE van de klassieke honingraatvorm (figuur 3B). Het kan ook RPE-multinucleatie detecteren, de aanwezigheid van drie of meer kernen in een RPE-cel (figuur 3C). Voor een samenvatting van de soorten RPE-pathologieën die aanwezig zijn in de huidige AMD-muismodellen, verwijzen we onderzoekers naar deze beoordelingen uit de literatuur 6,7.

Onderzoekers die AMD bestuderen, moeten zich bewust zijn van de voor- en nadelen van het gebruik van muizen om RPE-pathologieën te onderzoeken voorafgaand aan het fenotyperingsprotocol. Muizen zijn voordelig vanwege hun relatief korte levensduur en kosteneffectiviteit, evenals hun genetische en farmacologische manipuleerbaarheid. Muizen vertonen ook RPE-degeneratieve veranderingen, waaronder RPE-migratie, dysmorfie en multinucleatie, die worden waargenomen in AMD-donorogen 11,12,13,14,15,16,17; dit suggereert dat vergelijkbare mechanismen ten grondslag kunnen liggen aan de ontwikkeling van deze RPE-pathologieën bij muizen en mensen. Er zijn echter belangrijke verschillen die de vertaalbaarheid van muisstudies naar menselijke LMD beperken. Ten eerste hebben muizen geen macula, een anatomisch verschillend gebied van het menselijk netvlies dat nodig is voor de gezichtsscherpte die bij voorkeur wordt beïnvloed bij AMD. Ten tweede worden sommige RPE-pathologieën bij muizen, zoals RPE-verdunning en vacuolisatie, meestal niet gezien in AMD-donorogen18. Ten derde ontwikkelen muizen geen drusen, een kenmerk van AMD-pathologie19. Drusen zijn lipide- en eiwithoudende afzettingen met zeer weinig keldermembraaneiwitten die zich vormen tussen de RPE basale lamina en de binnenste collageenlaag van het membraan van Bruch (BrM)19. Drusen verschillen van BLamD, de veel voorkomende sub-RPE-afzetting bij muizen, zowel in hun samenstelling als in anatomische locatie. BLamD's zijn leeftijds- en stressafhankelijke extracellulaire matrixverrijkte afwijkingen die zich vormen tussen de RPE basale lamina van BrM en de basale infoldings van de RPE20. Interessant is dat BLamD's een vergelijkbare eiwitsamenstelling en uiterlijk hebben bij zowel muizen als mensen 6,10,21. Recent werk suggereert dat BLamDs kan werken in de pathobiologie van AMD door de progressie van AMD naar zijn latere stadia te beïnvloeden18,22; deze afzettingen kunnen dus zieke RPE in het netvlies van de muis vertegenwoordigen. Kennis van deze voordelen en beperkingen is van cruciaal belang voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het vertalen van resultaten van muisstudies naar AMD.

In dit protocol bespreken we de methoden om ogen voor te bereiden op licht, transmissie-elektron en confocale microscopie om RPE-pathologieën te visualiseren. We beschrijven ook hoe we RPE-pathologieën op een onbevooroordeelde manier kunnen kwantificeren voor statistische tests. Als proof of concept gebruiken we het RPE-fenotyperingsprotocol om de structurele RPE-pathologieën te onderzoeken die worden waargenomen in transmembraaneiwit 135- (Tmem135) overexpressiemuizen en verouderde wild-type (WT) C57BL / 6J-muizen. Samenvattend willen we de fenotyperingsmethodologie beschrijven om de RPE in AMD-muismodellen te karakteriseren, omdat er momenteel geen standaardprotocollen beschikbaar zijn. Onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het onderzoeken en kwantificeren van pathologieën van de fotoreceptoren of het vaatvlies, die ook worden beïnvloed in AMD-muismodellen, vinden dit protocol mogelijk niet nuttig voor hun studies.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedures met betrekking tot proefdieren zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee aan de Universiteit van Wisconsin-Madison en zijn in overeenstemming met de verklaring van de Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en visieonderzoek.

1. Evaluatie van muis RPE door middel van lichtmicroscopie

  1. Maak een fixatieve buffer met een eindconcentratie van 2% paraformaldehyde en 2% glutaaraldehyde bij kamertemperatuur (RT) in een glazen fles.
    OPMERKING: Dit protocol vereist maximaal 14 ml fixatieve buffer per muis.
    LET OP: Paraformaldehyde en glutaaraldehyde zijn gevaarlijke stoffen. Volg de standaard werkprocedures bij het werken met deze stoffen.
  2. Bereid een zwaartekrachttoevoerperfusiesysteem voor op een absorberend onderkussen voor hartperfusie in een zuurkast (aanvullende figuur 1A).
    1. Breng 40 ml van de fixerende buffer in het spuitvat van het perfusiesysteem (aanvullende figuur 1B).
    2. Draai de klep totdat deze evenwijdig is aan de buisleiding om de buffer door de buisleiding te laten stromen (aanvullende figuur 1C). Spoel de lijn door met buffer totdat alle luchtbellen uit de lijn zijn verwijderd.
    3. Draai de klep totdat deze loodrecht op de buisleiding staat om te voorkomen dat de buffer in de buisleiding stroomt (aanvullende figuur 1D).
      OPMERKING: Het perfusiesysteem is nu klaar voor gebruik.
  3. Euthanaseer de muis door deze in een koolstofdioxide (CO 2) kamer te plaatsen en laat CO2 in de kamer stromen met een stroomsnelheid van 30% van het kamervolume per minuut. Zodra de muis stopt met ademen, laat u CO2 gedurende ten minste 1 minuut in de kamer stromen. Controleer of de muis dood is voordat u doorgaat naar de volgende stap.
    OPMERKING: Euthanasie door injectie van farmacologische middelen kan in dit protocol worden gebruikt als alternatief voor CO 2-inhalatie.
  4. Voer hartperfusie uit op de geëuthanaseerde muis.
    1. Breng de muis over naar een ondiepe lade in de buurt van het perfusiesysteem met de buik naar boven gericht. Spuit de buik in met 70% ethanol (EtOH).
    2. Maak vier incisies om de buikholte bloot te leggen (aanvullende figuur 2A).
      1. Maak een 5 cm inferieure snede met behulp van een gebogen schaar en een tang door de huid en buikwand aan de verste linkerkant van de muis die zich direct onder de ribbenkast bevindt.
      2. Ga verder met het maken van een mediale snede van 3 cm door de huid en buikwand van de muis die begint aan de bovenkant van de inferieure snede.
      3. Maak nog een 5 cm inferieure snede aan het einde van de mediale snede door de huid en buikwand aan de verste rechterkant van de muis direct onder de ribbenkast.
      4. Maak nog een mediale incisie van 3 cm om de buikhuidflap met een gebogen tang te verwijderen.
    3. Snijd door het middenrif en borstbeen om het hart bloot te leggen (aanvullende figuur 2B).
      OPMERKING: Wees voorzichtig om te voorkomen dat het hart, de slagaders en de aderen worden geknepen. Het insnijden hiervan zal leiden tot een inefficiënte hartperfusie.
    4. Steek de meetnaald in de linkerkamer van het hart. Draai de klep totdat deze evenwijdig is aan de buisleiding. Knip het rechteratrium af met een gebogen schaar om bloed en fixatief het hart te laten verlaten (aanvullende figuur 2C).
    5. Laat 10 ml fixatieve buffer de muis binnendringen gedurende ten minste 1-2 minuten, of totdat de lever bleek van kleur wordt en er geen bloed uit het rechter atrium stroomt. Zodra de perfusie is voltooid, draait u de klep totdat deze loodrecht op de buisleiding staat om de stroom van de buffer te stoppen.
  5. Enucleate de ogen van de muis na hartperfusie.
    1. Haal de muis uit de ondiepe lade en plaats de muis op de absorberende onderlaag in een zuurkast. Richt de kop van de muis zodanig dat het linkeroog naar de experimentator is gericht en het rechteroog uit het zicht is. Annoteer de superieure kant van het oog met een weefselmarkeringskleurstof.
    2. Duw zachtjes met de duim en wijsvinger rond de oogkas om uitsteeksel van het oog uit de oogkas te veroorzaken (aanvullende figuur 3A).
    3. Neem een gebogen schaar en houd deze met het mes in een hoek van 30° van de oogkas. Ga verder met het knippen rond het oog met de gebogen schaar in een hoek van 30° (aanvullende figuur 3B).
      OPMERKING: Het is goed om overtollig weefsel uit de oogkas te snijden om de integriteit van de oogbol te behouden.
    4. Verwijder de oogbol van het hoofd met een gebogen tang en plaats deze op een absorberende onderlegger. Snijd het hoornvlies met een nummer 11 scalpelmesje en plaats het oog met een gebogen tang in een microbuisje van 2 ml met 2 ml fixatieve buffer. Label de microbuis van 2 ml met muisidentificatie en 'links' om het linkeroog aan te geven.
      OPMERKING: De inkeping in het hoornvlies zorgt ervoor dat het fixatief gemakkelijk het oog kan binnendringen om het beter te behouden.
    5. Herhaal stap 1.5.1-1.5.4 voor het rechteroog.
  6. Laat de ogen 's nachts in fixatieve buffer incuberen op een shaker in een ruimte van 4 °Celsius (C), met een snelheid van 75 omwentelingen per minuut (rpm).
  7. Vervang de fixatieve buffer door 2 ml 1x fosfaatbufferzoutoplossing (PBS). Incubeer de ogen in 1x PBS gedurende 10 minuten op een shaker bij RT en 75 rpm. Herhaal deze stap twee keer.
  8. Reinig en ontleed de ogen om achterste segmenten te genereren.
    OPMERKING: Het achterste segment is de oogbol van de muis met het neurale netvlies, RPE, vaatvlies en sclera zonder het hoornvlies, de iris en de lens.
    1. Plaats het oog in een petrischaaltje gevuld met 1x PBS onder een ontleedmicroscoop (aanvullende figuur 4A).
    2. Til vet en spieren voorzichtig weg van de oogbol met een tang met een fijne punt. Knip het vet en de spieren voorzichtig bij met een micro-ontleedschaar in een parallelle richting aan de oogbol totdat de oogbol een uniforme blauwzwarte kleur heeft (aanvullende figuur 4B).
      OPMERKING: Snijd niet loodrecht op, omdat dit de oogbol beschadigt. Ook als de weefselmarkeringskleurstof tijdens de verwerking loskomt, annoteer dan onmiddellijk de superieure kant van de oogbol.
    3. Plaats een tang met fijne punt op de plaats van de hoornvliespunctie. Knip rond de omtrek van het hoornvlies, beginnend bij de prikplaats, met een micro-ontleedschaar, om het hoornvlies en de iris uit de oogbol te verwijderen (aanvullende figuur 4C).
    4. Neem een tang met een fijne punt en verwijder voorzichtig de lens van de oogbol om het achterste segment te verkrijgen (aanvullende figuur 4D).
    5. Plaats het achterste segment terug in een microbuis van 2 ml met 2 ml 1x PBS. Bewaar het achterste segment in een koelkast van 4 °C.
      OPMERKING: Achterste segmenten kunnen vele weken in 1x PBS bij 4 °C blijven voordat ze verder worden verwerkt.
  9. Herhaal stap 1.3-1.8 om de ogen voor te bereiden op andere muizen in het onderzoek.
  10. Verwerk en sluit een van de achterste segmenten van elke muis in paraffine in voor sectie. Zorg ervoor dat de superieure kant van het achterste segment zich bovenop bevindt.
    OPMERKING: De auteurs vertrouwen op het laboratorium Translational Research Initiatives in Pathology (TRIP) van de Universiteit van Wisconsin-Madison (UW) om deze taken uit te voeren. Hier zijn gepubliceerde protocollen met behulp van een vergelijkbare paraffineverwerkings- en inbeddingsmethode23,24.
  11. Trim en snijd elk paraffineblok om een 5 μm dikke retinale sectie te verkrijgen die de oogzenuwkop omvat, evenals vier extra 5 μm dikke retinale secties die 250 μm van elkaar verwijderd zijn. Label de dia's met muisidentificatie en het serienummer (d.w.z. 1, 2, 3, 4 of 5). Sla de dia's op in een diavak.
    OPMERKING: De auteurs vertrouwen op het UW TRIP-laboratorium voor hun diensten in paraffinesectie. Hier zijn gepubliceerde protocollen met behulp van vergelijkbare paraffinesectiemethode25,26.
  12. Kleur de dia's met retinale secties met hematoxyline en eosine (H &E). Een protocol van H&E-kleuring is te vinden in aanvullende figuur 5.
    OPMERKING: Alle stappen van de H&E-kleuringsprocedure moeten in een zuurkast worden voltooid.
  13. Verzamel gestikte afbeeldingen van H&E-gekleurde retinale secties met een schaalbalk met behulp van een lichtmicroscoop bij 20x vergroting.
  14. Kwantificeer de RPE-dikte in de retinale beelden met de oogzenuwkop voor elk monster.
    1. Download en open het Fiji ImageJ-programma. Sleep alle gestikte netvliesafbeeldingen met de oogzenuwkop naar de Fiji ImageJ-taakbalk. Controleer of de afbeeldingsschaal is gekalibreerd in μm en niet in pixels.
      OPMERKING: De afbeeldingsschaal bevindt zich in de linkerbovenhoek van het venster met een netvliesafbeelding in het Fiji ImageJ-programma. Als de schaal is ingesteld in pixels, raadpleegt u de handleiding van het Fiji ImageJ-programma om pixels naar μm te converteren.
    2. Markeer elk interval van 300 μm in elk beeld van de rand van de oogzenuwkop tot het einde van het netvlies (ora serrata). Klik op het rechte pictogram in de Fiji ImageJ-taakbalk. Klik en sleep een lijn van de rand van de oogzenuwkop naar de ora serrata die 300 μm lang is. Klik op het gereedschap Penseel in de Fiji ImageJ-taakbalk en klik op het einde van de regel van 300 μm om deze te markeren.
    3. Meet de RPE-dikte bij elk gemarkeerd interval. Klik op het rechte pictogram in de Fiji ImageJ-taakbalk. Klik en sleep een lijn van boven naar beneden van de RPE (aanvullende afbeelding 6). Klik op Analyseren > meten in de Fiji ImageJ menubalk om de RPE-dikte te verkrijgen.
    4. Breng de RPE-diktemetingen over naar een spreadsheet en label de kolom met metingen met muisidentificatie. Label een extra kolom met 'Gemarkeerd interval' en voer de afstand in van de oogzenuwwaarden (d.w.z. 300, 600, 900, enz.)
      OPMERKING: Het eerste gemeten interval komt overeen met 300 μm afstand van de oogzenuw, het tweede gemeten interval komt overeen met 600 μm afstand, enzovoort.
  15. Kwantificeer de incidentie van RPE-pathologie op basis van de retinale beelden voor elk monster.
    1. Open het Fiji ImageJ-programma.
    2. Open de Cell Counter-applicatie binnen het Fiji ImageJ-programma. Klik op Plug-ins > Analyseer > celteller in de Fiji ImageJ-menubalk. Sleep een retinale afbeelding naar de Fiji ImageJ-taakbalk en klik op Initialiseren in het venster Celteller .
    3. Tel het aantal RPE-pathologieën per retinale sectie met behulp van de toepassing Cell Counter . Klik op Type 1 onder Tellers en klik vervolgens op alle microvacuolisatiegebeurtenissen in de afbeelding. Klik op Type 2 onder Tellers en klik vervolgens op alle macrovacuolisatiegebeurtenissen in de afbeelding. Klik op Type 3 onder Tellers en klik vervolgens op alle afzonderlijke migratiegebeurtenissen in de afbeelding.
    4. Breng de nummers van de RPE-pathologieën over naar een spreadsheet. Label de rijen met microvacuolisatie, macrovacuolisatie of migratie en de kolom met muisidentificatie.
    5. Herhaal stap 1.15.2-1.15.4 voor andere afbeeldingen van het voorbeeld. Gemiddelde van het aantal RPE-pathologieën per monster en deel door vijf om de incidentie van elke RPE-pathologie voor de steekproef in de spreadsheet te berekenen.
  16. Voer statistische analyse uit op de RPE-diktes bij elk interval en de incidentiepercentages van RPE-pathologie om te bepalen of er significante verschillen zijn tussen groepen in het onderzoek.

2. Evaluatie van muis RPE door transmissie-elektronenmicroscopie

  1. Snijd de andere achterste segmenten die na stap 1,5-1,9 zijn ontstaan door de superieure markering in tweeën met een scheermesje. Breng de superieure zijde van de doorsneden achterste segmenten opnieuw aan met weefselmarkeringskleurstof. Scheid de doorsneden achterste segmenten in nieuwe microbuisjes van 2 ml met 2 ml 1x PBS en muisidentificatie.
    OPMERKING: Het achterste segment van de muis is te groot om in één stuk te verwerken en moet in tweeën worden gesneden voor transmissie-elektronenmicroscopieverwerking.
  2. Spoel de weefsels met 2 ml cacodylaatbuffer van 0,1 M, pH 7,2. Incubeer gedurende 10 minuten bij RT op het bankje. Herhaal deze stap nog twee keer.
  3. Vervang de cacodylaatbuffer van 0,1 M door 2 ml 2% osmiumtetroxide (OsO4) verdund in een cacodylaatbuffer van 0,1 M. Incubeer gedurende 1,5 uur bij RT in de zuurkast.
    LET OP: OsO4 is een giftige stof. Volg de standaard operationele procedures bij het werken met OsO4.
  4. Spoel de weefsels met 2 ml cacodylaatbuffer van 0,1 M gedurende 10 minuten bij RT in de zuurkast. Herhaal deze stap één keer.
  5. Droog de weefsels uit met gegradueerde EtOH-verdunningen variërend van 50% tot 100% bij RT in de zuurkast. Een protocol voor de uitdrogingsprocedure is te vinden in aanvullende figuur 7.
  6. Verwijder 100% EtOH uit de weefsels en voeg 2 ml propyleenoxide toe aan weefsels. Incubeer bij RT in de zuurkast gedurende 15 min. Verwijder het propyleenoxide uit de weefsels en voeg 2 ml vers propyleenoxide toe aan de weefsels. Incubeer bij RT in de zuurkast gedurende 15 min.
    LET OP: Propyleenoxide is een giftige stof. Volg de standaard operationele procedures bij het werken met propyleenoxide.
  7. Verwijder propyleenoxide uit de weefsels en voeg 2 ml van een 1:1 mengsel van propyleenoxide en hars toe aan de weefsels. Laat een nacht onder vacuüm in de zuurkast bij RT staan.
    LET OP: Hars is een gevaarlijke stof voor de mens. Volg de standaard werkprocedures van het laboratorium bij het werken met hars.
  8. Vervang het 1:1 mengsel van propyleenoxide en hars uit weefsels door 2 ml zuivere hars. Laat een nacht onder een vacuüm in de zuurkast bij RT staan.
  9. Sluit de weefsels in hars in. Plaats een label met muisidentificatie in potlood en een druppel hars in de vorm. Plaats het weefsel op de druppel hars. Vul de mal met hars en plaats gedurende 1 uur onder een vacuüm bij RT in de zuurkast.
  10. Verplaats de etiketten en monsters met een tang met een fijne punt, met de achterste zijde van het achterste oogschelpgedeelte bovenop. Laat de vorm een nacht bij 65 °C in een oven in de zuurkast staan.
  11. Haal de vormpjes uit de oven. Laat de mallen afkoelen tot RT op het tafelblad. Verwijder de blokken uit de mallen.
    OPMERKING: De blokken zijn nu klaar om te trimmen.
  12. Vorm de harsblokken met een scheermesje tot een trapezium. Trim de harsblokken met behulp van een microtoom totdat de oogzenuwkop zichtbaar is. Gebruik een diamantmes om halfdunne secties uit de harsblokken te snijden met een dikte van 0,5 μm.
    OPMERKING: Hier is een gepubliceerd protocol over microtoomsectie27. Indien gewenst kunnen 0,5 μm dikke halfdunne secties van de harsblokken worden verzameld en gekleurd om de integriteit van het monster te evalueren.
  13. Snijd een 70 nm dikke ultradunne sectie van elk bijgesneden blok met behulp van een ultramicrotoom. Verzamel een 70 nm dikke ultradunne sectie op een 400-mesh dun staaf koperen rooster. Plaats het raster in een rasteropslagdoos en label de sleuf met muisidentificatie.
    OPMERKING: Hier is een gepubliceerd protocol over ultramicrotoom sectie28.
  14. Bevlek de roosters met 2% uranylacetaat gedurende 5 minuten en vervolgens met 3,5% loodcitraatoplossing gedurende 5 minuten bij RT in de zuurkast.
    LET OP: Uranylacetaat en loodcitraat zijn gevaarlijke stoffen. Volg de standaard operationele procedures bij het werken met deze stoffen.
  15. Verkrijg beelden voor elk monster met behulp van een transmissie-elektronenmicroscoop met een vergroting van 15.000x, waarbij de rasterlijnen van het koperen raster de RPE en BrM kruisen.
    OPMERKING: Er moeten ten minste 20 tot 35 afbeeldingen per sectie en 40 tot 70 afbeeldingen per monster zijn.
  16. Kwantificeer BLamD-hoogten in de afbeeldingen voor de monsters in het onderzoek.
    1. Open het Fiji ImageJ-programma. Sleep alle afbeeldingen uit de voorbeeldsectie naar de Fiji ImageJ-taakbalk. Controleer of de afbeeldingen zijn gekalibreerd in μm en niet in pixels.
    2. Meet de BLamD-hoogte in de afbeeldingen. Klik op het pictogram Recht in de taakbalk Fiji ImageJ. Klik en sleep een lijn van de elastische lamina van BrM naar de bovenkant van de hoogste afzetting in de afbeelding (aanvullende figuur 8). Klik op Analyseren > meten in de Fiji ImageJ-menubalk om de BLamD-hoogte in de afbeelding te verkrijgen.
      OPMERKING: Als er geen BLamD's in de afbeelding staan, trek dan een lijn van de elastische lamina van BrM naar de basale lamina van de RPE.
    3. Breng de BLamD-hoogten over naar een spreadsheet en label met muisidentificatie.
  17. Bereken de cumulatieve frequenties van BLamD-hoogten per genotype en gemiddelden van BLamD-hoogten per muis in de spreadsheet. Voer statistische analyse uit op de gemiddelden van BLamD-hoogten om te bepalen of er significante verschillen zijn tussen groepen in het onderzoek.

3. Evaluatie van muis RPE door middel van confocale microscopie

  1. Verzamel ogen van de muizen. Euthanaseer de muizen volgens de procedure beschreven in stap 1.3. Enucleate de ogen met behulp van stap 1.5. Plaats de ogen met een gebogen tang in een microbuis van 2 ml met 2 ml 1x PBS en muisidentificatie.
    OPMERKING: Pas de muizen niet donker aan, omdat de interdigitisatie van de fotoreceptoren en RPE-apicale processen een betere visualisatie van de RPE door middel van confocale microscopie mogelijk maakt.
  2. Reinig en ontleed de ogen van de muis onmiddellijk om achterste oogschelpen van de muis te genereren.
    OPMERKING: De achterste oogschelp verschilt van het achterste segment omdat deze het neurale netvlies niet bevat.
    1. Breng het oog over naar een petrischaaltje met 1x PBS onder een ontleedmicroscoop (aanvullende figuur 9A).
    2. Verwijder vet en spieren uit de oogbol, zoals beschreven in stap 1.8.2 (aanvullende figuur 9B).
    3. Nick het hoornvlies van de oogbol met een nummer 11 scalpelmesje. Verwijder het hoornvlies en de iris, zoals beschreven in stap 1.8.3 (aanvullende figuur 9C).
    4. Trek de lens uit met een tang met een fijne punt. Neem twee tangen met een fijne punt en scheid het neurale netvlies voorzichtig van het achterste segment.
    5. Snijd voorzichtig het neurale netvlies bij de oogzenuwkop door voor verwijdering uit de achterste oogschelp (aanvullende figuur 9D).
    6. Plaats de achterste oogschelp in een nieuwe microbuis van 2 ml met 500 μL 1x PBS met muisidentificatie.
  3. Bevestig de achterste oogschelpen met methanol (MeOH) (aanvullende figuur 10).
    OPMERKING: Stap 3.3 duurt ongeveer 2 uur en 40 minuten om te voltooien.
    1. Voeg 500 μL MeOH toe aan weefsels. Incubeer op een shaker bij 75 rpm gedurende 5 minuten bij RT.
    2. Verwijder de 500 μL oplossing uit de weefsels en voeg 500 μL MeOH toe. Incubeer gedurende 5 minuten op een shaker bij 75 rpm gedurende 5 minuten bij RT. Herhaal deze stap nog een keer.
    3. Verwijder de volledige oplossing uit de weefsels en voeg 500 μL MeOH toe. Incubeer op een shaker bij 75 tpm gedurende ten minste 2 uur bij RT.
      OPMERKING: Als alternatief voor stap 3.3.3 kan de achterste oogschelp 's nachts in MeOH worden geïncubeerd op een shaker bij 75 rpm in een ruimte van 4 °C.
    4. Voeg 500 μL 1x PBS toe aan de weefsels. Incubeer op een shaker bij 75 rpm gedurende 5 minuten bij RT.
    5. Verwijder de 500 μL oplossing uit de weefsels en voeg 500 μL 1x PBS toe. Incubeer op een shaker bij 75 rpm gedurende 5 minuten bij RT. Herhaal deze stap nog een keer.
    6. Verwijder de hele oplossing uit de weefsels en vervang deze door 500 μL 1x PBS.
      OPMERKING: De weefsels worden volledig gefixeerd door de MeOH en kunnen minstens 1 maand in een koelkast van 4 °C worden bewaard.
  4. Voer immunofluorescentiekleuring van de achterste oogschelpen uit om tight junctions en kernen van de RPE te visualiseren (aanvullende figuur 11).
    1. Verwijder de 500 μL van 1x PBS uit monsters en voeg 100 μL verdund 10% normaal ezelserum toe in 1x PBS-oplossing. Incubeer op een shaker bij 75 rpm gedurende 30 minuten bij RT.
    2. Verwijder de verdunde 10% normale ezelserumoplossing uit de monsters en voeg 100 μL van een 1:50 verdunning van een konijnenpolyklonaal anti-Zonula Occludens-1 (ZO-1) antilichaam toe in 1x PBS. Breng de monsters over naar een ruimte van 4 °C en incubeer een nacht op een shaker bij 75 tpm.
    3. Verwijder de antilichaamverdunning uit de monsters en voeg 2 ml 1x PBS toe. Incubeer op een shaker bij 75 rpm gedurende 10 minuten bij RT. Herhaal deze stap nog twee keer.
    4. Verwijder de 1x PBS uit de monsters. Voeg 100 μL van een 1:250 verdunning van een ezel anti-konijn IgG antilichaam met een 488 fluorofoor-geconjugeerd label en een 1:250 verdunning van 4',6-Diamidine-2'-fenylindooldihydrochloride (DAPI) in 1x PBS toe aan de monsters. Bedek de monsters met aluminiumfolie en incubeer op een shaker bij 75 rpm gedurende 2 uur bij RT.
      OPMERKING: De monsters moeten volledig worden bedekt met aluminiumfolie om fotobleken te voorkomen.
    5. Verwijder het antilichaam en de DAPI-verdunningen uit de monsters. Voeg 2 ml 1x PBS toe aan de monsters, dek opnieuw af met aluminiumfolie en incubeer op een shaker bij 75 rpm gedurende 10 minuten bij RT. Herhaal deze stap nog drie keer.
      OPMERKING: De tight junctions en kernen van de RPE zijn nu respectievelijk volledig gelabeld en gekleurd.
  5. Monteer de achterste oogschelpen op microscoopglaasjes.
    1. Label een microscoopglaasje met muisidentificatie. Breng de achterste oogschelp over op een microscoopglaasje onder een ontleedmicroscoop met de choroïdale zijde naar beneden gericht. Voeg een druppel van 1x PBS toe aan de achterste oogschelp om uitdroging te voorkomen (aanvullende figuur 12).
    2. Snijd de achterste oogschelp met behulp van een scalpelmes met nummer 11 op vier plaatsen die vier kwadranten opleveren die overeenkomen met de windrichtingen (d.w.z. noord, oost, zuid en west). Dep overtollige 1x PBS met weefsel van de omtrek van de achterste oogschelp. Druk de achterste oogschelp voorzichtig plat met een kamelenhaarborstel en een tang met fijne punt (aanvullende figuur 12).
      OPMERKING: Het resulterende product staat nu bekend als een RPE flat mount.
    3. Voeg een druppel montagemedium toe aan de RPE flat mount en plaats er een coverslip op. Breng doorzichtige nagellak aan om de coverslip af te dichten en laat deze minstens 30 minuten drogen bij RT in een gesloten lade. Plaats de dia's in een schuifdragerdoos en bewaar de doos in een koelkast van 4 °C.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u geen bubbels op de RPE-vlakke houder introduceert. RPE flat mounts kunnen binnen een tijdsbestek van 2 weken in beeld worden gebracht.
  6. Verkrijg een beeld van elk van de vier kwadranten rond de oogzenuw van de RPE flat mount op een confocale microscoop bij 20x vergroting voor elk monster. Een voorbeeld van een RPE flat mount image is te vinden in Aanvullende Figuur 13A.
    OPMERKING: Het kan nodig zijn om z-stack imaging uit te voeren van de RPE flat mounts waarbij meerdere images worden gemaakt en gestapeld om dimensionale verschillen van de RPE flat mount te compenseren.
  7. Traceer de tight junctions van de RPE-cellen binnen elke RPE-installatiekopie met vlakke montage. Een voorbeeld van een getraceerde RPE flat mount image is te vinden in aanvullende figuur 13B.
    1. Open het Fiji ImageJ-programma. Sleep een RPE-installatiekopie voor vlakke montage naar de taakbalk Fiji ImageJ. Controleer of de afbeelding is gekalibreerd in micrometers en niet in pixels.
    2. Dubbelklik op het pictogram Overlay Brush Tool in de Fiji ImageJ-taakbalk om de penseelbreedte in te stellen op 3, transparantie op 0 en kleur op rood. Klik op de knop Sluiten in het venster Overlaypenseel .
    3. Klik op het pictogram Overlay-penseel . Klik en sleep op de tight junctions van alle RPE-cellen die zich volledig in de afbeelding bevinden.
      OPMERKING: Als er een overtrekfout wordt gemaakt, dubbelklikt u op het pictogram Overlaypenseel en klikt u op het vak Ongedaan maken in het venster Overlaypenseel om de overtrekfout uit de afbeelding te verwijderen.
    4. Klik op het pictogram Rechthoek op de taakbalk Fiji ImageJ. Klik op de afbeelding en sleep rond de omtrek van de afbeelding. Klik op Bewerken > wissen op de menubalk Fiji ImageJ om de overgetrokken lijnen te behouden en eventuele blauwe en groene kleuren uit de afbeelding te verwijderen.
    5. Sla de traceerafbeelding op een geschikte locatie op met muisidentificatie, kwadrantlocatie (d.w.z. noord, zuid, oost of west) en een CP-achtervoegsellabel.
      OPMERKING: Sla de RPE-traceerimage niet op voordat u stap 3.7.4 hebt voltooid.
  8. Bereken de RPE-celgebieden voor elk monster.
    1. Wijs een locatie aan om de bestanden uit RPE-gebiedsanalyse op te slaan door een map op het bureaubladscherm van de computer te maken. Genereer submappen voor elke RPE-traceerafbeelding en label de submappen met muisidentificatie en kwadrantlocatie (d.w.z. noord, zuid, oost of west).
    2. Installeer en open het Cell Profiler-programma29. Download het projectbestand Ikeda_RPE Area Calculator.cpproj (Supplementary Coding File 1). Open het bestand Ikeda_RPE Area Calculator.cpproj door te klikken op Bestand > Project openen in de menubalk van het Cell Profiler-programma.
    3. Sleep één RPE-traceerafbeelding naar het vak Afbeelding > Bestanden en mappen hier neerzetten in het programmavenster Cell Profiler.
    4. Voer de locatie van de map in het programma Cell Profiler in die overeenkomt met de RPE-traceerafbeelding. Klik op de knop Uitvoerinstellingen in de linkerbenedenhoek van het programmavenster Cell Profiler en voer de locatie van de map in de tekstvakken Standaardinvoermap en Standaarduitvoermap in.
    5. Klik op de knop Afbeeldingen analyseren in de linkerbenedenhoek van het programmavenster Cell Profiler. Nadat de analyse is voltooid, verschijnt het venster Analyse voltooid op het scherm. Klik op de knop OK in het venster Analyse voltooid .
      OPMERKING: Met deze actie worden een csv-bestand en een jpeg-afbeelding gegenereerd. Het csv-bestand bevat de gebieden voor de RPE-cellen in de traceerafbeelding. De jpeg-afbeelding komt overeen met de RPE-traceerafbeelding, waarbij elke RPE-cel wordt gelabeld met een nummer (aanvullende afbeelding 13C).
    6. Breng de RPE-gebieden over van het csv-bestand naar een spreadsheet. Label de spreadsheet met muisidentificatie.
    7. Voer een kwaliteitscontroleonderzoek uit naar de gegevens door te bevestigen dat elk RPE-gebied in het csv-bestand is gekoppeld aan een volledig getraceerde RPE-cel in een jpeg-afbeelding. Verwijder alle waarden uit de spreadsheet die niet overeenkomen met volledig getraceerde RPE-cellen.
    8. Ga terug naar het programma Cell Profiler. Klik met de rechtermuisknop op de naam van de RPE-traceerafbeelding in het vak Bestanden en mappen hier neerzetten en selecteer De lijst wissen om de afbeelding uit het programma Celprofiel te verwijderen.
    9. Herhaal stap 3.8.3-3.8.8 om de RPE-grootten te berekenen voor de resterende drie RPE-traceerafbeeldingen van het monster.
  9. Kwantificeer de gemiddelde RPE-celgrootte voor elk voorbeeld in de spreadsheet.
  10. Kwantificeer de RPE-celdichtheden voor elk voorbeeld in de spreadsheet. Om de RPE-celdichtheid te berekenen, deelt u het totale aantal RPE-cellen per kwadrant door het totale oppervlak van RPE-cellen per kwadrant dat is gedetecteerd door het Cell Profiler-programma. Bepaal het gemiddelde van de RPE-celdichtheden uit de vier kwadranten per monster.
  11. Kwantificeer het aantal meerkernige RPE-cellen per RPE flat mount voor elk monster. Gebruik de toepassing Cell Counter binnen het Fiji ImageJ-programma, zoals beschreven in stappen 1.15.1-1.15.3, om het aantal RPE-cellen met meer dan drie kernen in vier kwadranten van het monster te tellen.
  12. Voer statistische analyse uit op de RPE-celgrootte en dichtheidsgemiddelden, evenals het aantal meerkernige RPE-cellen om te bepalen of er significante verschillen zijn tussen groepen in het onderzoek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Voltooiing van het RPE-fenotyperingsprotocol dat in dit artikel wordt beschreven, biedt een kwantitatieve analyse van de structurele RPE-afwijkingen die vaak worden waargenomen in muismodellen van AMD. Om de effectiviteit van dit protocol te bevestigen, gebruikten we het bij muizen waarvan bekend is dat ze RPE-pathologieën vertonen, waaronder transgene muizen die WT Tmem135 overexpressie geven, aangedreven door de kip beta-actine promotor (Tmem135 TG)30 en oude C57BL/6J muizen31,32. Het doel van deze experimenten is om representatieve resultaten te laten zien die kunnen worden verkregen met behulp van de methoden die in dit protocol worden beschreven aan onderzoekers die nieuw zijn in muismodellen.

We hielden ons aan de methoden in stap 1 van het protocol om ogen van WT- en Tmem135 TG-muizen te verwerken en te evalueren om RPE-pathologieën te evalueren met behulp van lichtmicroscopie. We ontdekten dat 4 maanden oude Tmem135 TG-muizen een significante vermindering van de RPE-dikte hebben met twee gemeten intervallen ten opzichte van leeftijdsgematchte WT door middel van een ANOVA met post-hoc Tukey-test (figuur 4). Deze resultaten geven aan dat de RPE dunner is in de 4 maanden oude Tmem135 TG-muizen dan in leeftijdsgematchte WT-muizen op 600 en 900 μm afstand van de oogzenuw.

Bovendien hebben we, met behulp van de methoden van stap 1 van het protocol, de incidentie van RPE-pathologieën berekend, waaronder microvacuolisatie, macrovacuolisatie en migratie van drie 25 dagen oude WT- en Tmem135 TG-muizen (figuur 5A). De gemiddelde frequentie van RPE-microvacuolisatiepathologieën per dia bij WT-muizen was 0,67 ± 0,31 en bij Tmem135 TG-muizen was 7,07 ± 0,61 (figuur 5B). Er was geen RPE-macrovacuolisatie bij WT-muizen, maar er waren gemiddeld 5,33 ± 2,02 macrovacuolisatiegebeurtenissen bij Tmem135 TG-muizen (figuur 5C). Ten slotte was de snelheid van migrerende RPE-cellen per dia nul bij WT-muizen en 0,4 ± 0,35 bij Tmem135 TG-muizen (figuur 5D). Na het uitvoeren van de t-test van een student was de incidentie van RPE-microvacuolisatie en microvacuolisatie significant verschillend tussen WT- en Tmem135 TG-muizen. De hogere incidentie van RPE-migratiecellen in Tmem135 TG-muizen was echter niet significant verschillend in vergelijking met WT (p = 0,1161). Deze gegevens tonen aan dat RPE-microvacuolisatie en macrovacuolisatie, maar niet migratie, significant hoger is bij 25 dagen oude Tmem135 TG dan WT-muizen.

Volgens de methoden van het protocol in stap 2 hebben we netvliessecties van 2 maanden oude en 24 maanden oude WT C57BL / 6J-muizen voorbereid voor transmissie-elektronenmicroscopie om de aanwezigheid en hoogten van BLamD's te analyseren. We vonden BLamD's aanwezig in 24 maanden oude WT-netvliezen die opvallend afwezig waren in 2 maanden oude WT-netvliezen (figuur 6A). We presenteerden de hoogten van de BLamD's in de 24 maanden oude WT-netvliezen door de cumulatieve frequenties van hun voorkomen te berekenen en uit te zetten. Cumulatieve frequenties van de BLamD-hoogten werden in een grafiek weergegeven tegen de afzettingshoogte om de verdeling van de afzettingshoogten te illustreren. Er is een verschuiving naar rechts van de lijn voor de 24 maanden oude WT BLamD-hoogten in vergelijking met de 2 maanden oude WT BLamD-hoogten, wat een toename van afzettingen bij 24 maanden oude WT-muizen aantoont (figuur 6B). Deze grafiek wordt ondersteund door een groter gemiddelde van BLamD-hoogten in 24 maanden oude WT-netvliezen (1,01 μm ± 0,43 μm) dan 2 maanden oude WT-netvliezen (0,23 μm ± 0,017 μm), die significant verschilden door de t-test van een student (figuur 6C). Samenvattend concluderen we dat 24 maanden oude WT-muizen grote BLamD's hebben in de sub-RPE-ruimte van hun netvlies in vergelijking met 2 maanden oude WT-muizen.

We hebben de methoden voor het voorbereiden van ogen van 4 maanden oude WT- en Tmem135 TG-muizen in stap 3 toegepast om RPE-flatmounts te genereren voor de detectie en analyse van RPE-dysmorfie en multinucleatie. In dit protocol definieerden we RPE-dysmorfie door veranderingen in RPE-celgrootte en -dichtheid in een AMD-muismodel ten opzichte van hun besturingselementen. We ontdekten dat de RPE in 4 maanden oude Tmem135 TG-muizen dysmorf is (figuur 7A). De RPE in Tmem135 TG-netvliezen zijn groter (806,89 μm 2 ± 252,67 vs. 291,69 μm 2 ± 26,31) en minder dicht (0,0014 cellen/μm 2 ± 0,00039 vs. 0,0033 cellen/μm 2 ± 0,00024) dan leeftijdsgematchte WT-netvliezen (figuur 7B,C). Bovendien waren er meer meerkernige RPE-cellen in de Tmem135 TG-netvliezen in vergelijking met WT-controles (8,04 cellen ± 5,54 versus 0,33 cellen ± 0,29) (figuur 7D). Al deze parameters bereikten statistische significantie met de t-test van een student. Samen hebben 4 maanden oude Tmem135 TG-muizen meer dysmorfe en meerkernige RPE-cellen dan 4 maanden oude WT-muizen.

Figure 1
Figuur 1: RPE-pathologieën gedetecteerd door lichtmicroscopie. Representatieve beelden van normale RPE in WT (A) en abnormale RPE in Tmem135 TG-muizen (B-E). De RPE-pathologieën waargenomen in Tmem135 TG-muizen omvatten RPE-verdunning (B), macrovacuolisatie (C), microvacuolisatie (D) en migratie (E). Elke pathologie wordt geïllustreerd door een zwarte pijl. Schaalbalk = 100 μm. Vergroting = 20x. Afkortingen: RGC = retinale ganglioncellaag, IPL = binnenste plexiforme laag, INL = binnenste nucleaire laag, OPL = buitenste plexiforme laag, ONL = buitenste nucleaire laag, IS = fotoreceptor binnenste segmenten, OS = fotoreceptor buitenste segmenten, RPE = retinaal gepigmenteerd epitheel, Cho = vaatvlies. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: RPE-pathologieën gedetecteerd door transmissie-elektronenmicroscopie. Representatieve beelden van (A) RPE bij jonge CFH-H/H en (B) 2-jarige CFH-H/H muizen met overvloedige basale laminaire afzettingen (BLamD's). BLamD's worden getraceerd met gele stippen in de afbeelding. Schaalbalk = 800 nm. Vergroting = 15.000x. Afkortingen: N = nucleus, M = mitochondrion, P = pigmentkorrel, BI = basale infoldings, EL = elastische lamina, RPE = retinaal gepigmenteerd epitheel, BrM = Bruch's membraan, Cho = vaatvlies. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: RPE-pathologieën gedetecteerd door confocale microscopie. Representatieve beelden van (A) normale RPE van 8 maanden oude WT en (B) abnormale RPE van 8 maanden oude Tmem135 TG-muizen die RPE-dysmorfie vertonen. Het witte vierkant is ingezoomd (C) om een meerkernige RPE-cel met drie kernen weer te geven. De groene kleur is anti-ZO1 geassocieerde RPE tight junctions en de blauwe kleur is DAPI-kleuring van RPE-kernen. Schaalbalk = 50 μm. Vergroting = 20x. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: RPE-dikte bij 4 maanden oude wild-type (WT) en Tmem135 TG muizen. (A) Representatieve beelden van het netvlies van 4 maanden oude WT- en Tmem135 TG (TG) muizen. Vergroting = 20x. Schaalbalk = 100 μm. (B) Lijngrafieken van de RPE-diktemetingen in 4 maanden oude WT (zwart) en Tmem135 TG-muizen (groen) tot 3.000 μm verwijderd van de oogzenuw. Getallen na het genotype geven het aantal muizen aan dat in deze studie is gebruikt. *p < 0,05, ANOVA met post-hoc Tukey test. Alle gegevens zijn gemiddeld ± sd. Zie de legenda van figuur 1 voor afkortingen van retinale lagen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: RPE-pathologieën bij 25 dagen oude Tmem135 TG-muizen. (A) Representatieve beelden van RPE-microvacuolisatie, macrovacuolisatie en migratie in drie 25 dagen oude Tmem135 TG (TG) muizen. RPE-pathologieën worden gemarkeerd door zwarte pijlen in elke afbeelding. Vergroting = 40x. Schaalbalk = 20 μm. (B-D) Kwantificering van RPE micro- en macrovacuolisatie en migrerende RPE-cellen in 25 dagen oude WT- en Tmem135 TG-muizen. Getallen tussen haakjes geven het aantal muizen aan dat in deze studie is gebruikt. *p < 0,05 en ****p < 0,0001, t-toets van de student. Alle gegevens zijn gemiddeld ± sd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Ultrastructurele analyse van BLamD's in jonge en oude WT-netvliezen . (A) Representatieve elektronenmicrografieën van 2 maanden oude en 24 maanden oude WT RPE. Vergroting = 15.000x. Schaalbalk = 800 nm. Een voorbeeld van een basale laminaire afzetting (BLamD) is met een beugel in kaart gebracht. (B) Cumulatieve frequenties van de BLamD-hoogten. (C) BLamD-hoogtegemiddelden. Getallen tussen haakjes geven het totale aantal muizen per genotype aan dat in deze studie is gebruikt. **p < 0,01, t-toets van de student. Alle gegevens zijn gemiddeld ± sd. Zie de legenda van figuur 2 voor afkortingen van retinale lagen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: RPE flat mounts onthullen RPE pathologieën in Tmem135 TG muizen. (A) Representatieve beelden van 4 maanden oude WT en Tmem135 TG (TG) RPE flat mounts met anti-ZO-1 in groen en DAPI in blauw. Vergroting = 20x. Schaalbalk = 100 μm. (B) RPE-celgrootte, (C) RPE-celdichtheid en (D) RPE-multinucleatie bij 4 maanden oude WT- en Tmem135 TG-muizen. Het getal tussen haakjes geeft het aantal muizen aan dat in het onderzoek is gebruikt. *p < 0,05, **p < 0,01 en ****p < 0,0001, t-toets van de student. Alle gegevens zijn gemiddeld ± sd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Schema van de opstelling en het gebruik van hartperfusie. (A) Gravity-feed perfusiesysteem. (B) Spuitvat van het perfusiesysteem voor fixatieve buffer. (C) Klep die moet worden gedraaid totdat deze evenwijdig is aan de buisleiding om de buffer door de buisleiding te laten stromen. (D) Klep die moet worden gedraaid totdat deze loodrecht op de buisleiding staat om te voorkomen dat de buffer in de buisleiding stroomt. Afbeelding gemaakt in Biorender. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Schema van de procedure voor hartperfusie van een muis. (A) Vier incisies gemaakt om de buikholte bloot te leggen. (B) Snijd door het middenrif en borstbeen om het hart bloot te leggen. (C) Ijknaald ingebracht in de linker ventrikel van het hart. De klep wordt gedraaid totdat deze evenwijdig is aan de buisleiding. Het rechter atrium wordt met een gebogen schaar geknipt om bloed en fixatief naar buiten te laten. Afbeelding gemaakt in Biorender. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 3: Schema van de procedure om ogen van een muis te enucleeren. (A) Duw zachtjes met de duim en wijsvinger rond de oogkas om uitsteeksel van het oog uit de oogkas te veroorzaken. (B) Neem een gebogen schaar en houd deze met het mes in een hoek van 30° van de oogkas. Ga verder met het knippen rond het oog met de gebogen schaar in een hoek van 30°. Gekleurde stippen vertegenwoordigen de plaatsing van de vinger op de muis of een gebogen schaar. Afbeelding gemaakt in Biorender. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 4: Foto's van muisoogdissectie om het achterste segment van de muis op te leveren. (A) Oog overgebracht naar een ontleedmicroscoop. (B) Vet en spieren verwijderd uit de oogbol. (C) Hoornvlies en iris verwijderd uit de oogbol. (D) Lens verwijderd van de oogbol. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 5: Hematoxyline eosine (H&E) kleuringsprocedure. Schematische weergave van de H &E-procedure om paraffine-ingebedde retinale secties te kleuren. Pijlen geven de overdracht tussen stappen aan. De tijd van elke stap wordt in rood lettertype gegeven. Reagentia voor beitsen worden geleverd in zwart lettertype in glazen beitscontainers. Er moet een glasvlekcontainer worden voorbereid voor elk reagens dat in het bovenstaande diagram is opgenomen. Alle stappen moeten worden voltooid in een zuurkast. Wanneer u een coverslip aan een dia toevoegt, moet u oppassen dat u geen bubbels in de dia introduceert. Na voltooiing van de procedure kunnen dia's worden opgeslagen in een diadoos. Afbeelding gemaakt in Biorender. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 6: Voorbeeld van RPE-diktemeting. De zwarte pijl geeft een rode lijn weer van boven naar beneden van de RPE. Deze lijn kan worden gemeten om de dikte van de RPE te bepalen. Schaalbalk = 100 μm. Vergroting = 20x. Het ingepakte gebied is uitgezoomd voor een eenvoudigere weergave van de RPE. Zie de legenda van figuur 1 voor afkortingen van retinale lagen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 7: EtOH-dehydratieprocedure van achterste segmenten van muizen voor TEM-verwerking. Afbeelding gemaakt in Biorender. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 8: Voorbeeld van BLamD-hoogtemeting. De rode lijn toont de grootste BLamD in deze afbeelding. Gele stippen bakenen BLamD's in de afbeelding af. Deze rode lijn kan worden gemeten om de hoogte van deze BLamD in deze afbeelding te bepalen. Schaalbalk = 800 nm. Vergroting = 15.000x. Zie de legenda van figuur 2 voor afkortingen van retinale lagen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 9: Muisoogdissectie voor RPE flat mount. (A) Oog overgebracht naar een petrischaaltje met 1x PBS onder een ontleedmicroscoop. (B) Vet en spieren verwijderd uit de oogbol. (C) Hoornvlies en iris verwijderd uit de oogbol. (D) Lens en netvlies verwijderd van de oogbol. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 10: Methanol (MeOH) fixatieprocedure van de achterste oogschelpen van muizen. Afbeelding gemaakt in Biorender. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 11: Immunofluorescentieprocedure voor het labelen van tight junctions en kernen van RPE-cellen. Diagram met stappen van immunofluorescentietechniek uit dit protocol. Let op: deze techniek duurt 2 dagen om te voltooien. Alle stappen vinden plaats bij RT en op een shaker met een snelheid van 75 tpm, tenzij specifiek vermeld in het diagram. Het primaire (1°) antilichaam dat in deze studie werd gebruikt was konijn polyklonaal anti-ZO1, en het secundaire (2º) antilichaam dat in deze studie werd gebruikt was 488 fluorofoor-geconjugeerde ezel anti-konijn IgG. Zodra het secundaire antilichaam en DAPI aan de monsters zijn toegevoegd, moeten de monsters in aluminiumfolie worden gewikkeld om te beschermen tegen fotobleaching van het monster. Afbeelding gemaakt in Biorender. Afkortingen: NDS = normaal ezelsserum, Ab = antilichaam. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 12: Afbeelding van sneden om vier kwadranten van muis RPE flat mount op te leveren. N = noord, E = oost, S = zuid, W = west. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 13: Voorbeelden van RPE flat mount analyse-eindpunten. (A) RPE flat mount afbeelding. (B) RPE-grenstraceringsafbeelding. (C) RPE Cell Profiler geanalyseerde afbeelding. Vergroting = 20x. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend coderingsbestand 1: Ikeda RPE Area Calculator.cpproj Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In dit artikel hebben we een fenotyperingsprotocol geïntroduceerd voor het beoordelen van de structurele RPE-pathologieën van muismodellen. We beschreven de stappen die nodig zijn voor het verwerken van de ogen voor verschillende beeldvormingstechnieken, waaronder licht, transmissie-elektron en confocale microscopie, evenals de kwantificering van typische pathologieën die via deze beeldvormingsmethoden worden waargenomen. We hebben de effectiviteit van ons RPE-fenotyperingsprotocol bewezen door Tmem135 TG- en 24 maanden oude WT-muizen te onderzoeken, omdat deze muizen RPE-pathologieën 30,31,32 vertonen. Dit protocol kan worden toegepast op elke genetisch gemodificeerde of farmacologisch behandelde muis die RPE-pathologieën kan bevatten, zoals RPE-verdunning, vacuolisatie, migratie en dysmorfie, evenals BLamDs 6,7. Hoewel de RPE-pathologieën waargenomen in Tmem135 TG- en 24 maanden oude WT-muizen aanwezig zijn in andere AMD-muismodellen 7,30, is het belangrijk voor de onderzoeker om vertrouwd te raken met het AMD-muismodel dat voor hun studies is gekozen, omdat de leeftijd van aanvang en de ernst van de RPE-pathologieën van hun AMD-muismodel kunnen verschillen van de Tmem135 TG en 24 maanden oude WT-muizen. Onderzoekers moeten mogelijk meer muizen gebruiken voor hun studies dan het aantal muizen dat wordt gebruikt om de representatieve resultaten in dit artikel te produceren, als de presentatie van RPE-pathologieën variabel is in hun respectieve AMD-muismodel. Bovendien zijn veel AMD-muismodellen momenteel beschikbaar voor AMD-onderzoekers, maar hebben ze geen volledige beschrijvingen van hun RPE-pathologieën, waardoor onderzoekers mogelijk voorstudies moeten uitvoeren om deze informatie te verkrijgen.

Hoewel er wijzigingen kunnen worden aangebracht in de manier waarop muisogen worden verwerkt voor de verschillende beeldvormingsmethoden, is het van cruciaal belang om de kwantitatieve evaluatie van structurele RPE-afwijkingen zoals beschreven in het protocol te handhaven. Vijf H &E-gekleurde retinale secties werden bijvoorbeeld voorbereid om het aantal RPE-microvacuolisatie, macrovacuolisatie en migratiegebeurtenissen te tellen, waardoor onderzoekers RPE-pathologieën op meerdere locaties in het netvlies van de muis konden evalueren. Een ander voorbeeld is het gebruik van een 400-mesh dun staaf koperen elektronenmicroscopierooster om de ultrastructurele afwijkingen van de RPE te beoordelen. Het elektronenmicroscopieraster biedt een kader om een retinaal monster systematisch en onbevooroordeeld te evalueren door transmissie-elektronenmicrografie, evenals 40 tot 70 afbeeldingen per retinale sectie te verkrijgen om de aanwezigheid van BLamD's te onderzoeken. Dit kan niet worden bereikt met een elektronenmicroscopie-slotraster en we raden aan ze niet met dit protocol te gebruiken. Ten slotte stelt het vastleggen van 20x vergrotingsbeelden van de vier kwadranten van een RPE-flat mount onderzoekers in staat om grote gebieden van murine RPE te onderzoeken op dysmorfie en multinucleatie. Onderzoekers zijn vrij om dit protocol uit te breiden en aanvullende retinale secties voor RPE-pathologieën in hun studies te onderzoeken. Samen stellen deze methoden onderzoekers in staat om voldoende gegevens te verzamelen om conclusies te trekken over de structurele RPE-pathologieën die aanwezig kunnen zijn in hun AMD-muismodellen.

Een ander belangrijk kenmerk van dit protocol is de consistentie van de RPE-fenotyperingsmethoden. Alle ogen die werden gebruikt voor licht- en transmissie-elektronenmicroscopie waren bijvoorbeeld georiënteerd door de superieure kant van het netvlies van de muis voor secties. Het is belangrijk om de oriëntatie van het muisoog te behouden tijdens de verwerking voor licht- en transmissie-elektronenmicroscopie, omdat het muizenoog een topografische verdeling van retinale cellen heeft33,34. De anatomische oriëntatie van het muisoog werd niet gehandhaafd voor RPE flat mount-voorbereiding, omdat superieure tot inferieure topografische veranderingen van de muis RPE-cel niet zijn waargenomen. In feite vertoont de RPE in het menselijk netvlies topografische veranderingen die wegstralen van de oogzenuwkop35, wat suggereert dat dit het geval kan zijn voor muis RPE. Ten slotte is de beeldacquisitie die in dit protocol wordt beschreven afhankelijk van de anatomische positionering van de oogzenuw. Opname van deze methodologische aspecten zal helpen om resultaten van RPE-pathologieën voor onderzoekers te reproduceren terwijl ze met hun AMD-muismodellen werken.

Onderzoekers willen mogelijk meer analytische functies toevoegen aan het RPE-fenotyperingsprotocol. Sommige fenotypische uitkomsten die niet in dit protocol voorkomen, zijn het onderzoek van BrM-dikte, RPE-apicale microvilli en andere RPE-ultrastructurele componenten. Deze componenten omvatten mitochondriën, pigmentkorrels en andere organellen zoals fagosomen. Onderzoekers kunnen de grootte en het aantal van deze componenten bepalen in de elektronenmicrografieën die met dit protocol zijn verkregen met behulp van het Fiji ImageJ-programma. In het bijzonder kan de status van mitochondriën een belangrijke fenotypische uitkomst zijn om te overwegen, omdat het richten op mitochondriën in de RPE een belangrijke therapeutische strategie is voor AMD36. Een andere fenotypische uitkomst zijn aanvullende metingen van RPE-dysmorfie op RPE-flatmounts. RPE flat mount images verkregen met behulp van het protocol kunnen worden onderzocht op RPE hexagonale vorm, aantal naburige RPE-cellen en andere eigenschappen met het REShAPE-programma (https://github.com/nih-nei/REShAPE)35. Een andere mogelijke fenotypische uitkomst is of RPE-pathologieën voorkomen in de centrale of perifere gebieden van het netvlies van de muis. Deze aanvullende fenotypische overwegingen zullen het RPE-fenotyperingsprotocol dat in dit artikel wordt beschreven, verder versterken.

Er zijn een paar beperkingen van dit RPE-fenotyperingsprotocol. Een beperking van deze methode is de noodzaak om muizen op te offeren om hun ogen te oogsten voor RPE-fenotypering. Als alternatief maken nieuwe ontwikkelingen in spectrale domein optische coherentietomografie (SD-OCT) beeldvorming de kwantificering van RPE-dikte en pathologieën bij levende muizen37-39 mogelijk. Dit kan voordelig zijn voor onderzoekers die longitudinale studies willen uitvoeren op hun AMD-muismodelcohorten. Een andere beperking van deze methode is het ontbreken van functionele RPE-beoordelingen bij muizen. Als onderzoekers geïnteresseerd zijn in een functionele beoordeling van de RPE bij muizen, raden we aan elektroretinografie uit te voeren en de c-golfcomponent te meten, omdat de c-golf indicatief is voor de functionele rol van de RPE in fototransductie40. Een andere beperking van deze methode is het ontbreken van biochemische metingen van RPE-markers bij muizen. Als onderzoekers de niveaus van RPE-markers willen onderzoeken, zoals cellulair retinaldehyde-bindend eiwit (CRABLP), retinale pigmentepitheel-specifieke 65 kDa-eiwit (RPE65), kalium naar binnen corrigerende kanaalsubfamilie J-lid 13 (KCNJ13) of bestrofine 1 (BEST1), raden we aan ogen te oogsten voor immunohistochemie, kwantitatieve real-time PCR of western blot-analyse.

Kortom, dit RPE-fenotyperingsprotocol kan een belangrijke bron zijn voor onderzoekers die muismodellen gebruiken die pathologische aspecten van AMD samenvatten. Dit protocol dient ook om te standaardiseren hoe de RPE wordt geëvalueerd in AMD-muismodellen, wat niet eerder in de literatuur is beschreven. Het standaardiseren van RPE-fenotypering zou van cruciaal belang zijn bij het vertalen van de bevindingen van muizen naar andere modellen van AMD, waaronder RPE-celcultuurmodellen4 en hogere organismemodellen inclusief niet-menselijke primaten. Het zou ook helpen bij ons begrip van de pathobiologische mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van AMD en mogelijk het ontwikkelen van nieuwe therapieën voor deze verblindende ziekte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs van dit protocol hebben geen openbaarmakingen en belangenconflicten.

Acknowledgments

De auteurs willen Satoshi Kinoshita en de University of Wisconsin (UW) Translational Research Initiatives in Pathology laboratory (TRIP) bedanken voor het voorbereiden van onze weefsels op lichtmicroscopie. Deze kern wordt ondersteund door het UW Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Wisconsin Carbone Cancer Center (P30 CA014520) en het Office of The Director-NIH (S10OD023526). Confocale microscopie werd uitgevoerd in de UW Biochemistry Optical Core, die werd opgericht met steun van de UW Department of Biochemistry Endowment. Dit werk werd ook ondersteund door subsidies van het National Eye Institute (R01EY022086 aan A. Ikeda; R01EY031748 naar C. Bowes Rickman; P30EY016665 naar de afdeling Oogheelkunde en Visuele Wetenschappen van het UW; P30EY005722 naar het Duke Eye Center; NIH T32EY027721 naar M. Landowski; F32EY032766 aan M. Landowski), Timothy William Trout Chairmanship (A. Ikeda), FFB Free Family AMD Award (C. Bowes Rickman); en een onbeperkte subsidie van het Research to Prevent Blindness (Duke Eye Center).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 M Cacodylate Buffer pH7.2 PolyScientiifc R&D Company S1619
100 Capacity Slide Box Two are needed for this protocol (one for H&E-stained slides and one for RPE flat mounts.)
100% Ethanol  MDS Warehouse 2292-CASE Can be used to make diluted ethanol solutions in this protocol.
1-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks Qosina 11069
1x Phosphate Buffer Solution (PBS) Premade 1x PBS can be used in this protocol. 
2.0 mL microtubes Genesee Scientific  24-283-LR
24 Cavity Embedding Capsule Substitute Mold Electron Microscopy Sciences 70165
24 inch PVC Tubing with Luer Ends Fisher Scientific NC1376778
400 Mesh Gilder Thin Bar Square Mesh Grids Electron Microscopy Sciences T400-Cu
95% Ethanol MDS Warehouse 2293-CASE
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier (23 inches by 24 inches) VWR 56616-031
Adjustable 237 ml  Spray Bottle VWR 23609-182
Alexa Fluor488 Conjugated Donkey anti-Rabbit IgG  Thermo Fisher Scientific A-21206
Aluminum Foil
BD Precision glide 19 Gauge Syringe Needle Sigma-Aldrich  Z192546
Bracken Forceps; Curved; Fine Cross Serrations; 4" Length, 1 mm Tip Width Roboz Surgical Instrument RS-5211 Known as curved forceps in this protocol.
Camel Hair Brush Electron Microscopy Sciences 65575-02
Carbon Dioxide Euthanasia Chamber
Carbon Dioxide Flow Meter
Carbon Dioxide Tank
Castaloy Prong Extension Clamps Fisher Scientific  05-769-7Q
Cast-Iron L-shaped Base Support Stand Fisher Scientific  11-474-207
Cell Prolifer Program Available to download: https://cellprofiler.org/releases
Clear Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180
Colorfrost Microscope Slides Lavender VWR 10118-956
Computer
DAPI Sigma-Aldrich D9542-5MG
Distilled H20 Water from Milli-Q Purification System was used in this protocol.
Dumont Thin Tip Tweezers; Pattern #55 Roboz Surgical Instrument RS-4984 Known as fine-tipped forceps in this protocol, and 3 are needed for this protocol (two for dissections and one for electron microscope processing).
Electron Microscopy Grid Holder Electron Microscopy Sciences 71147-01
EPON 815 Resin Electron Microscopy Sciences 14910
Epredia Mark-It Tissue Marking Yellow Dye Fisher Scientific  22050460 Please follow manufacturer's protocol when using this tissue marking dye. 
Epredia Mounting Media Fisher Scientific 22-110-610 Use for mounting H&E slides. 
Fiber-Lite Mi-150 Illuminator Series,150 w Halogen Light Source Dolan-Jenner Industries Mi-150 Light source for dissecting microscope.
Fiji ImageJ Program Available to download: https://imagej.net/downloads
Flexaframe Castaloy Hook Connector Thermo Scientific   14-666-18Q
Fume hood
Glutaraldehyde 2.5% in Phosphate Buffer, pH 7.4, 32% Electron Microscopy Sciences 16537-05
JEM-1400 Transmission Electron Microscope (JEOL) with an ORIUS (1000) CCD Camera
Laboratory Benchtop Shaker Two are needed for these experiments. One should be at room temperature while the other should be in a 4 degree Celsius cold room.
Laser Cryo Tag Labels Electron Microscopy Sciences 77564-05
Lead Citrate Electron Microscopy Sciences 17800
Leica EM UC7Ultramicrotome
Leica Reichert Ultracut S Microtome
LifterSlips Thermo Fisher Scientific 22X22I24788001LS Use these coverslips for the RPE flat mounts as they have raised edges and accommodate the thickness of the RPE.
Mayer's Hematoxylin VWR 100504-406
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors Roboz Surgical Instrument RS-5600 Known as micro-dissecting scissors in protocol. 
Methanol Fisher Scientific  A412-4
Mice Any AMD mouse model and its respective controls can work for this protocol.
Micro Dissecting Scissors; Standard Version; Curved; Sharp Points; 24 mm Blade Length; 4.5" Overall Length Roboz Surgical Instrument RS-5913 Known as curved scissors in this protocol.
Microsoft Excel
Microtube racks
Nikon A1RS Confocal Microscope
Normal Donkey Serum SouthernBiotech 0030-01
Number 11 Sterile Disposable Scalpel Blades VWR 21909-380
Osmium Tetroxide  Electron Microscopy Sciences 19150
Paraformaldehyde, 32% Electron Microscopy Sciences 15714-S
Pencil
Petri Dish VWR  21909-380
Pipette Tips
Pipettes 
Polyclonal Anti-ZO-1 Antibody Thermo Fisher Scientific 402200
Propylene Oxide Electron Microscopy Sciences 20412
Razor Blade VWR 10040-386
Shallow Tray for Mouse Perfusions
Shandon Eosin Y Alcoholic VWR 89370-828
Sharpie Ultra Fine Tip Black Permanent Marker Staples 642736
Slide Rack for Staining Grainger 49WF31
Squared Cover Glass Slips Fisher Scientific  12-541B
Staining Dish with Cover Grainger 49WF30 Need 15 for H&E staining procedure.
Target All-Plastic Disposable Luer-Slip 50 mL Syringe  Thermo Scientific  S7510-50 Use only the syringe barrel.
Timer Fisher 1464917
Uranyl Acetate Electron Microscopy Sciences 22400
Vacuum Oven
Vectashield Mounting Medium Vector Laboratories H-1000 Use for mounting RPE flat mounts. 
Xylene Fisher Scientific  22050283
Zeiss Axio Imager 2 Light Microscope This microscope has the capacity to generate stitched 20x images. If a light microscope does not have this capacity, then take images of the entire retina that are slightly overlapping each other. Use Adobe Photoshop to stitch these images together. Please refer to the manuals of the Adobe Photoshop program for image stitching. 
Zeiss Stemi 2000 Dissecting Microscope Electron Microscopy Sciences 65575-02

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet. Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).
  2. Bhutto, I., Lutty, G. Understanding age-related macular degeneration (AMD): relationships between the photoreceptor/retinal pigment epithelium/Bruch's membrane/choriocapillaris complex. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 295-317 (2012).
  3. Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progess in Retinal and Eye Research. 100846, (2020).
  4. Bharti, K., et al. Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 222, 109170 (2022).
  5. Forest, D. L., Johnson, L. V., Clegg, D. O. Cellular models and therapies for age-related macular degeneration. Disease Models & Mechanisms. 8 (5), 421-427 (2015).
  6. Landowski, M., Bowes Rickman, C. Targeting lipid metabolism for the treatment of age-related macular degeneration: Insights from preclinical mouse models. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 38 (1), 3-32 (2022).
  7. Pennesi, M. E., Neuringer, M., Courtney, R. J. Animal models of age related macular degeneration. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 487-509 (2012).
  8. Malek, G., Busik, J., Grant, M. B., Choudhary, M. Models of retinal diseases and their applicability in drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 13 (4), 359-377 (2018).
  9. Cao, D., et al. Hyperreflective foci, optical coherence tomography progression indicators in age-related macular degeneration, include transdifferentiated retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 62 (10), 34 (2021).
  10. Ding, J. D., et al. Expression of human complement factor H prevents age-related macular degeneration-like retina damage and kidney abnormalities in aged Cfh knockout mice. The American Journal of Pathology. 185 (1), 29-42 (2015).
  11. Zanzottera, E. C., et al. The project MACULA retinal pigment epithelium grading system for histology and optical coherence tomography in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 56 (5), 3253-3268 (2015).
  12. Ding, J. D., et al. Anti-amyloid therapy protects against retinal pigmented epithelium damage and vision loss in a model of age-related macular degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (28), 279-287 (2011).
  13. Zhang, Q., et al. Comparison of histologic findings in age-related macular degeneration with RPE flatmount images. Molecular Vision. 25, 70-78 (2019).
  14. vonder Emde, L., et al. Histologic cell shape descriptors for the retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: A comparison to unaffected eyes. Translational Vision Science & Technology. 11 (8), 19 (2022).
  15. Gambril, J. A., et al. Quantifying retinal pigment epithelium dysmorphia and loss of histologic autofluorescence in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 60 (7), 2481-2493 (2019).
  16. Bird, A. C., Phillips, R. L., Hageman, G. S. Geographic atrophy: a histopathological assessment. JAMA Ophthalmology. 132 (3), 338-345 (2014).
  17. Zanzottera, E. C., et al. Visualizing retinal pigment epithelium phenotypes in the transition to geographic atrophy in age-related macular degeneration. Retina. 36, 12-25 (2016).
  18. Sura, A. A., et al. Measuring the contributions of basal laminar deposit and Bruch's membrane in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 61 (13), 19 (2020).
  19. Curcio, C. A. Soft drusen in age-related macular degeneration: biology and targeting via the oil spill strategies. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 59 (4), 160 (2018).
  20. Johnson, M., et al. Comparison of morphology of human macular and peripheral Bruch's membrane in older eyes. Current Eye Research. 32 (9), 791-799 (2007).
  21. Sarks, S. H., Arnold, J. J., Killingsworth, M. C., Sarks, J. P. Early drusen formation in the normal and aging eye and their relation to age related maculopathy: a clinicopathological study. The British Journal of Ophthalmology. 83 (3), 358-368 (1999).
  22. Chen, L., Messinger, J. D., Kar, D., Duncan, J. L., Curcio, C. A. Biometrics, impact, and significance of basal linear deposit and subretinal drusenoid deposit in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 62 (1), 33 (2021).
  23. Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).
  24. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protocols. 2008, (2008).
  25. Cornell, W. C., et al. Paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis. Journal of Visualized Experiments. (133), e57196 (2018).
  26. Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. Journal of Visualized Experiments. (139), e58288 (2018).
  27. Baena, V., Schalek, R. L., Lichtman, J. W., Terasaki, M. Serial-section electron microscopy using automated tape-collecting ultramicrotome (ATUM). Methods in Cell Biology. 152, 41-67 (2019).
  28. Yamaguchi, M., Chibana, H. A method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (131), e56235 (2018).
  29. Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433 (2021).
  30. Landowski, M., et al. Modulation of Tmem135 leads to retinal pigmented epithelium pathologies in mice. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 61 (12), 16 (2020).
  31. Mori, H., et al. Developmental and age-related changes to the elastic lamina of Bruch's membrane in mice. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (2), 289-301 (2019).
  32. Chen, M., et al. Retinal pigment epithelial cell multinucleation in the aging eye - a mechanism to repair damage and maintain homoeostasis. Aging Cell. 15 (3), 436-445 (2016).
  33. Ortín-Martínez, A., et al. Number and distribution of mouse retinal cone photoreceptors: differences between an albino (Swiss) and a pigmented (C57/BL6) strain. PLoS One. 9 (7), 102392 (2014).
  34. El-Danaf, R. N., Huberman, A. D. Sub-topographic maps for regionally enhanced analysis of visual space in the mouse retina. The Journal of Comparative Neurology. 527 (1), 259-269 (2019).
  35. Ortolan, D., et al. Single-cell-resolution map of human retinal pigment epithelium helps discover subpopulations with differential disease sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (19), 2117553119 (2022).
  36. Brown, E. E., Lewin, A. S., Ash, J. D. Mitochondria: Potential targets for protection in age-related macular degeneration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 11-17 (2018).
  37. Puk, O., De Angelis, M. H., Graw, J. Longitudinal fundus and retinal studies with SD-OCT: a comparison of five mouse inbred strains. Mammalian Genome. 24 (5-6), 198-205 (2013).
  38. Knott, E. J., Sheets, K. G., Zhou, Y., Gordon, W. C., Bazan, N. G. Spatial correlation of mouse photoreceptor-RPE thickness between SD-OCT and histology. Experimental Eye Research. 92 (2), 155-160 (2011).
  39. Allen, R. S., Bales, K., Feola, A., Pardue, M. T. In vivo structural assessments of ocular disease in rodent models using optical coherence tomography. Journal of Visualized Experiments. (161), e61588 (2020).
  40. Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).

Tags

Deze maand in JoVE nummer 193
Een protocol voor het evalueren en kwantificeren van retinale gepigmenteerde epitheelpathologieën in muismodellen van leeftijdsgebonden maculaire degeneratie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Landowski, M., Grindel, S., Hao, Y., … More

Landowski, M., Grindel, S., Hao, Y., Ikeda, S., Bowes Rickman, C., Ikeda, A. A Protocol to Evaluate and Quantify Retinal Pigmented Epithelium Pathologies in Mouse Models of Age-Related Macular Degeneration. J. Vis. Exp. (193), e64927, doi:10.3791/64927 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter