Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Yaşa Bağlı Makula Dejenerasyonunun Fare Modellerinde Retinal Pigmentli Epitel Patolojilerini Değerlendirme ve Ölçme Protokolü

Published: March 10, 2023 doi: 10.3791/64927
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 1,2, 3,4, 1,2
1Department of Medical Genetics, University of Wisconsin-Madison, 2McPherson Eye Research Institute, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Ophthalmology, Duke University, 4Department of Cell Biology, Duke University

Summary

Fare modelleri, retinal pigmentli epitelin (RPE) biyolojisini araştırmak için yararlı araçlar olabilir. Farelerin bir dizi RPE patolojisi geliştirebileceği tespit edilmiştir. Burada, ışık, iletim elektronu ve konfokal mikroskopi kullanarak farelerde RPE patolojilerini aydınlatmak ve ölçmek için bir fenotipleme protokolü tarif ediyoruz.

Abstract

Yaşa bağlı makula dejenerasyonu (YBMD), yaşlanan popülasyonlarda zayıflatıcı bir retina hastalığıdır. Retinal pigmente epitel (RPE) disfonksiyonunun YBMD'de önemli bir patobiyolojik olay olduğuna inanılmaktadır. RPE disfonksiyonuna yol açan mekanizmaları anlamak için, fare modelleri araştırmacılar tarafından kullanılabilir. Önceki çalışmalarla, farelerin, bazıları AMD tanısı alan bireylerin gözlerinde gözlenen RPE patolojileri geliştirebileceği tespit edilmiştir. Burada, farelerde RPE patolojilerini değerlendirmek için bir fenotipleme protokolü tanımlanmaktadır. Bu protokol, ışık mikroskobu ve transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak retinal kesitlerin hazırlanmasını ve değerlendirilmesini ve ayrıca konfokal mikroskopi ile RPE düz montajlarının hazırlanmasını ve değerlendirilmesini içerir. Bu tekniklerle gözlemlenen yaygın murin RPE patolojileri türlerini ve bunları istatistiksel testler için tarafsız yöntemlerle ölçmenin yollarını detaylandırıyoruz. Kavram kanıtı olarak, bu RPE fenotipleme protokolünü, transmembran protein 135'i (Tmem135) aşırı eksprese eden farelerde ve yaşlı vahşi tip C57BL / 6J farelerde gözlenen RPE patolojilerini ölçmek için kullanıyoruz. Bu protokolün temel amacı, AMD'nin fare modellerini kullanan bilim adamları için standart RPE fenotipleme yöntemlerini tarafsız nicel değerlendirmelerle sunmaktır.

Introduction

Yaşa bağlı makula dejenerasyonu (YBMD), 55 yaşın üzerindeki popülasyonları etkileyen yaygın bir körleme hastalığıdır1. Birçok araştırmacı, retinal pigmentli epitel (RPE) içindeki disfonksiyonun AMD2'de erken ve önemli bir patobiyolojik olay olduğuna inanmaktadır. RPE, komşu fotoreseptörlerin ve koroidal kan damarlarının homeostazını korumakla görevli polarize hücrelerin tek katmanlıdır3. RPE içindeki hastalıkla ilişkili mekanizmaları araştırmak için, hücre kültürü modelleri 4,5 ve fareler 6,7,8 dahil olmak üzere çeşitli modeller mevcuttur. Yakın tarihli bir rapor, RPE hücre kültürü modelleri4 için standartlaştırılmış protokolleri ve kalite kontrol kriterlerini tanımlamıştır, ancak hiçbir rapor fare modellerinde RPE'nin fenotiplemesini standartlaştırmaya çalışmamıştır. Aslında, AMD'nin fare modelleri üzerine yapılan birçok yayın, RPE'nin tam bir tanımından veya içlerindeki RPE patolojilerinin nicelleştirilmesinden yoksundur. Bu protokolün genel amacı, AMD fare modellerini kullanan bilim adamları için standart RPE fenotipleme yöntemlerini tarafsız nicel değerlendirmelerle sunmaktır.

Önceki yayınlar, üç görüntüleme tekniği ile farelerde çeşitli RPE patolojilerinin varlığına dikkat çekmiştir. Örneğin, ışık mikroskobu, araştırmacıların murin retinasının brüt morfolojisini görmelerini (Şekil 1A) ve RPE incelmesi, vakuolizasyon ve göç gibi RPE patolojilerini tespit etmelerini sağlar. Bir AMD fare modelindeki RPE inceltmesi, RPE yüksekliğindeki ilgili kontrollerden sapma ile örneklendirilir (Şekil 1B). RPE vakuolizasyonu iki ayrı kategoriye ayrılabilir: mikrovakuolizasyon (Şekil 1C) ve makrovakuolizasyon (Şekil 1D). RPE mikrovakuolizasyonu, RPE'de toplam yüksekliğini etkilemeyen vakuollerin varlığı ile özetlenirken, makrovakuolizasyon, fotoreseptörlerin dış segmentlerine çıkıntı yapan vakuollerin varlığı ile gösterilir. RPE migrasyonu, retinal bir kesitte RPE tek katmanının üzerindeki pigmentin fokal agregası ile ayırt edilir (Şekil 1E). AMD donör gözlerindeki göçmen RPE hücrelerinin, farklılaşma kümesi 68 (CD68)9 gibi immünoreaktivite gösterdikleri ve RPE enkazını veya transdiferansiyasyon9 geçiren RPE'yi yutan bağışıklık hücrelerini temsil edebileceği unutulmamalıdır. İletim elektron mikroskobu adı verilen başka bir görüntüleme tekniği, araştırmacıların RPE'nin ve bazal zarının ultrayapısını görselleştirmelerine izin verebilir (Şekil 2A). Bu teknik, bazal laminer tortu (BLamD) olarak bilinen farelerde baskın sub-RPE birikintisini tanımlayabilir (Şekil 2B)10. Son olarak, konfokal mikroskopi, RPE düz montajlarını görüntüleyerek RPE hücrelerinin yapısını ortaya çıkarabilir (Şekil 3A). Bu yöntem, RPE dismorfisini, RPE'nin klasik petek şeklinden sapmasını ortaya çıkarabilir (Şekil 3B). Ayrıca RPE multinükleasyonunu, bir RPE hücresi içinde üç veya daha fazla çekirdeğin varlığını tespit edebilir (Şekil 3C). Mevcut AMD fare modellerinde bulunan RPE patolojilerinin bir özeti için, araştırmacıları literatürden bu incelemelere yönlendiriyoruz 6,7.

AMD'yi inceleyen araştırmacılar, fenotipleme protokolünden önce RPE patolojilerini araştırmak için fare kullanmanın avantaj ve dezavantajlarının farkında olmalıdır. Fareler, nispeten kısa ömürleri ve maliyet etkinliklerinin yanı sıra genetik ve farmakolojik manipüle edilebilirlikleri nedeniyle avantajlıdır. Fareler ayrıca AMD donör gözlerindegözlenen RPE göçü, dismorfi ve çoklu çekirdeklenme dahil olmak üzere RPE dejeneratif değişiklikler sergiler 11,12,13,14,15,16,17; bu, benzer mekanizmaların farelerde ve insanlarda bu RPE patolojilerinin gelişiminin altında yatabileceğini düşündürmektedir. Bununla birlikte, fare çalışmalarının insan AMD'sine çevrilebilirliğini sınırlayan önemli farklılıklar vardır. İlk olarak, farelerde AMD'de tercihen etkilenen görme keskinliği için gerekli olan insan retinasının anatomik olarak farklı bir bölgesi olan bir makula yoktur. İkincisi, farelerde RPE incelmesi ve vakuolizasyon gibi bazı RPE patolojileri tipik olarak AMD donör gözlerinde görülmez18. Üçüncüsü, fareler AMD patolojisinin ayırt edici bir özelliği olan drusen geliştirmezler19. Drusen, RPE bazal lamina ile Bruch zarının (BrM) iç kollajenöz tabakası arasında oluşan çok az bazal membran proteinine sahip lipit ve protein içeren birikintilerdir19. Drusen, farelerde ortak alt RPE birikintisi olan BLamD'den hem bileşimlerinde hem de anatomik konumlarında farklılık gösterir. BLamD'ler, BrM'nin RPE bazal laminası ile RPE20'nin bazal kıvrımları arasında oluşan yaşa ve strese bağlı hücre dışı matriks ile zenginleştirilmiş anormalliklerdir. İlginç bir şekilde, BLamD'ler hem farelerde hem de insanlarda benzer bir protein bileşimine ve görünümüne sahiptir 6,10,21. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, BLamD'lerin AMD'nin sonraki aşamalarına ilerlemesini etkileyerek AMD'nin patobiyolojisinde hareket edebileceğini düşündürmektedir18,22; Bu nedenle, bu birikintiler fare retinasında hastalıklı RPE'yi temsil edebilir. Bu faydalar ve sınırlamalar hakkında bilgi sahibi olmak, fare çalışmalarından elde edilen sonuçları AMD'ye çevirmek isteyen araştırmacılar için kritik öneme sahiptir.

Bu protokolde, RPE patolojilerini görselleştirmek için gözleri ışığa, iletim elektronuna ve konfokal mikroskopiye hazırlama yöntemlerini tartışıyoruz. Ayrıca, istatistiksel testler için RPE patolojilerinin tarafsız bir şekilde nasıl ölçüleceğini de açıklıyoruz. Kavramın kanıtı olarak, transmembran protein 135- (Tmem135) aşırı eksprese eden farelerde ve yaşlı vahşi tip (WT) C57BL / 6J farelerde gözlenen yapısal RPE patolojilerini araştırmak için RPE fenotipleme protokolünü kullanıyoruz. Özetle, AMD fare modellerinde RPE'yi karakterize etmek için fenotipleme metodolojisini tanımlamayı amaçlıyoruz, çünkü şu anda standart protokoller mevcut değildir. AMD fare modellerinde de etkilenen fotoreseptörlerin veya koroidin patolojilerini incelemek ve ölçmek isteyen araştırmacılar, bu protokolü çalışmaları için yararlı bulamayabilirler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hayvan denekleri içeren tüm prosedürler, Wisconsin-Madison Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır ve Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı için Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği (ARVO) Beyanı ile uyumludur.

1. Fare RPE'sinin ışık mikroskobu ile değerlendirilmesi

  1. Bir cam şişede oda sıcaklığında (RT) son konsantrasyonu% 2 paraformaldehit ve% 2 glutaraldehit içeren fiksatif bir tampon yapın.
    NOT: Bu protokol, fare başına en fazla 14 mL fiksatif arabellek gerektirir.
    DİKKAT: Paraformaldehit ve glutaraldehit tehlikeli maddelerdir. Lütfen bu maddelerle çalışırken standart çalışma prosedürlerini izleyin.
  2. Bir duman davlumbazında kardiyak perfüzyon için emici bir alt ped üzerinde bir yerçekimi beslemeli perfüzyon sistemi hazırlayın (Ek Şekil 1A).
    1. Fiksatif tamponun 40 mL'sini perfüzyon sisteminin şırınga haznesine yerleştirin (Ek Şekil 1B).
    2. Tamponun boru hattından akmasına izin vermek için valfi boru hattına paralel olana kadar çevirin (Ek Şekil 1C). Tüm hava kabarcıkları hattan çıkarılana kadar çizgiyi tamponla yıkayın.
    3. Tamponun boru hattına akmasını durdurmak için valfi boru hattına dik olana kadar çevirin (Ek Şekil 1D).
      NOT: Perfüzyon sistemi artık kullanıma hazırdır.
  3. Fareyi bir karbondioksit (CO 2) odasına yerleştirerek ötenazi yapın ve CO2'nin dakikada oda hacminin% 30'luk bir akış hızında odaya akmasına izin verin. Fare nefes almayı bıraktığında, CO2'nin odaya en az 1 dakika akmasına izin verin. Sonraki adıma geçmeden önce farenin öldüğünü doğrulayın.
    NOT: Farmakolojik ajanların enjeksiyonu yoluyla ötenazi, bu protokolde CO2 inhalasyonuna alternatif olarak kullanılabilir.
  4. Ötanazi farede kardiyak perfüzyon yapın.
    1. Fareyi, karnı yukarı bakacak şekilde perfüzyon sisteminin yakınındaki sığ bir tepsiye aktarın. Karnına% 70 etanol (EtOH) püskürtün.
    2. Karın boşluğunu açığa çıkarmak için dört insizyon yapın (Ek Şekil 2A).
      1. Göğüs kafesinin hemen altındaki farenin en uzak sol tarafındaki deri ve karın duvarından kavisli makas ve forseps kullanarak 5 cm daha düşük bir kesim oluşturun.
      2. Alt kesimin tepesinden başlayan farenin derisinden ve karın duvarından 3 cm'lik bir medial kesim yapmaya devam edin.
      3. Medialin sonunda, göğüs kafesinin hemen altındaki farenin en uzak sağ tarafındaki deri ve karın duvarından 5 cm daha aşağı kesim yapın.
      4. Kavisli forsepslerle abdominal deri flebini çıkarmak için 3 cm'lik başka bir medial kesi yapın.
    3. Kalbi açığa çıkarmak için diyaframı ve sternumu kesin (Ek Şekil 2B).
      NOT: Kalbin, atardamarların ve damarların tıkanmasından kaçınmaya dikkat edin. Bunları çentiklemek verimsiz bir kardiyak perfüzyona yol açacaktır.
    4. Gösterge iğnesini kalbin sol ventrikülüne yerleştirin. Vanayı boru hattına paralel olana kadar çevirin. Kanın ve fiksatifin kalpten çıkmasına izin vermek için sağ atriyumu kavisli makasla kesin (Ek Şekil 2C).
    5. 10 mL fiksatif tamponun fareye en az 1-2 dakika boyunca veya karaciğer soluk renkli hale gelene ve sağ atriyumdan kan akmayana kadar nüfuz etmesine izin verin. Perfüzyon tamamlandıktan sonra, tamponun akışını durdurmak için valfi boru hattına dik olana kadar çevirin.
  5. Kardiyak perfüzyondan sonra gözleri fareden enükleat.
    1. Fareyi sığ tepsiden çıkarın ve fareyi bir duman başlığındaki emici alt pedin üzerine yerleştirin. Farenin kafasını, sol gözü deneyciye bakacak ve sağ göz görüş alanı dışında kalacak şekilde yönlendirin. Gözün üst tarafına bir doku işaretleme boyası ile açıklama ekleyin.
    2. Gözün göz yuvasından çıkıntısına neden olmak için başparmak ve işaret parmağınızla göz yuvasının etrafına hafifçe bastırın (Ek Şekil 3A).
    3. Kavisli makas alın ve bıçakla göz yuvasından 30° açıyla tutun. Kavisli makasla göz çevresini 30° açıyla kesmeye devam edin (Ek Şekil 3B).
      NOT: Göz küresinin bütünlüğünü korumak için göz yuvasından fazla dokunun kesilmesi uygundur.
    4. Göz küresini kavisli forseps ile kafadan çıkarın ve emici bir alt pedin üzerine yerleştirin. Korneayı 11 numaralı neşter bıçağı ile birleştirin ve kavisli forsepsli gözü 2 mL fiksatif tampona sahip 2 mL'lik bir mikrotüpe yerleştirin. Sol gözü belirtmek için 2 mL'lik mikrotüpü fare kimliği ve 'sol' ile etiketleyin.
      NOT: Korneadaki çentik, fiksatifin daha iyi korumak için göze kolayca nüfuz etmesini sağlar.
    5. Sağ göz için 1.5.1-1.5.4 arasındaki adımları tekrarlayın.
  6. Gözlerin, dakikada 75 dönüş (rpm) hızında, 4 ° Santigrat (C) odadaki bir çalkalayıcıda gece boyunca fiksatif tamponda inkübe olmasına izin verin.
  7. Fiksatif tamponu 2 mL 1x fosfat tampon salin (PBS) ile değiştirin. Gözleri RT ve 75 rpm'de bir çalkalayıcıda 10 dakika boyunca 1x PBS'de inkübe edin. Bu adımı iki kez yineleyin.
  8. Arka segmentleri oluşturmak için gözleri temizleyin ve disseke edin.
    NOT: Arka segment, nöral retina, RPE, koroid ve sklera ile kornea, iris ve lens ile fare göz küresidir.
    1. Gözü diseksiyon mikroskobu altında 1x PBS ile doldurulmuş bir Petri kabına yerleştirin (Ek Şekil 4A).
    2. Herhangi bir yağ ve kası ince uçlu forsepslerle göz küresinden yavaşça kaldırın. Göz küresi düzgün bir mavimsi-siyah renge sahip olana kadar yağ ve kası mikro disseke edici makasla göz küresine paralel yönde dikkatlice kesin (Ek Şekil 4B).
      NOT: Göz küresine zarar verdiği için dik yönde kesmeyin. Ayrıca, doku işaretleme boyası işleme sırasında çıkarsa, göz küresinin üst tarafına derhal yeniden açıklama ekleyin.
    3. İnce uçlu forsepsleri kornea delinme bölgesine yerleştirin. Kornea ve irisi göz küresinden çıkarmak için delinme bölgesinden başlayarak korneanın çevresini mikro diseksiyon makası ile kesin (Ek Şekil 4C).
    4. İnce uçlu forseps alın ve arka segmenti elde etmek için lensi göz küresinden yavaşça çıkarın (Ek Şekil 4D).
    5. Arka segmenti 2 mL 1x PBS ile 2 mL'lik bir mikrotüpe geri yerleştirin. Arka segmenti 4 °C'lik bir buzdolabında saklayın.
      NOT: Arka segmentler, daha fazla işlem yapılmadan önce haftalarca 4 ° C'de 1x PBS'de kalabilir.
  9. Gözleri çalışmadaki diğer farelerden hazırlamak için 1.3-1.8 adımlarını tekrarlayın.
  10. Bölümleme için her farenin arka segmentlerinden birini işleyin ve parafine yerleştirin. Arka segmentin üst tarafının üstte olduğundan emin olun.
    NOT: Yazarlar bu görevleri yerine getirmek için Wisconsin-Madison Üniversitesi (UW) Patolojide Translasyonel Araştırma Girişimleri (TRIP) laboratuvarına güvenmektedir. İşte benzer bir parafin işleme ve gömme yöntemi kullanılarak yayınlanan protokoller23,24.
  11. Optik sinir kafasını içeren 5 μm kalınlığında bir retina bölümünün yanı sıra birbirinden 250 μm uzaklıkta dört ek 5 μm kalınlığında retinal bölüm elde etmek için her parafin bloğunu kırpın ve kesinleştirin. Slaytları fare kimliği ve seri bölüm numarasıyla (örneğin, 1, 2, 3, 4 veya 5) etiketleyin. Slaytları bir slayt kutusunda saklayın.
    NOT: Yazarlar parafin kesitlemedeki hizmetleri için UW TRIP laboratuvarına güvenmektedir. İşte benzer parafin kesitleme yöntemi25,26 kullanılarak yayınlanan protokoller.
  12. Retina kesitleri içeren slaytları hematoksilin ve eozin (H&E) ile lekeleyin. H&E boyama protokolü Ek Şekil 5'te bulunabilir.
    NOT: H&E boyama prosedürünün tüm adımları bir duman davlumbazında tamamlanmalıdır.
  13. H&E boyalı retina kesitlerinin dikişli görüntülerini, 20x büyütmede bir ışık mikroskobu kullanarak bir ölçek çubuğuyla toplayın.
  14. Her numune için optik sinir kafasını içeren retinal görüntülerdeki RPE kalınlığını ölçün.
    1. Fiji ImageJ programını indirin ve açın. Optik sinir kafasını içeren tüm dikişli retinal görüntüleri Fiji ImageJ görev çubuğuna sürükleyin. Görüntü ölçeğinin piksel cinsinden değil, μm cinsinden kalibre edildiğini doğrulayın.
      NOT: Görüntü ölçeği, Fiji ImageJ programında retinal bir görüntü içeren pencerenin sol üst köşesinde bulunur. Ölçek piksel cinsinden ayarlanmışsa, pikselleri μm'ye dönüştürmek için lütfen Fiji ImageJ programının kullanım kılavuzuna bakın.
    2. Her görüntüde her 300 μm aralığında, optik sinir başının kenarından retinanın sonuna (ora serrata) kadar işaretleyin. Fiji ImageJ görev çubuğundaki Düz simgesine tıklayın. Optik sinir kafasının kenarından 300 μm uzunluğundaki ora serrata'ya doğru bir çizgiyi tıklayın ve sürükleyin. Fiji ImageJ görev çubuğundaki Boya Fırçası aracına tıklayın ve işaretlemek için 300 μm satırın sonuna tıklayın.
    3. İşaretlenen her aralıkta RPE kalınlığını ölçün. Fiji ImageJ görev çubuğundaki Düz simgesine tıklayın. RPE'nin üstünden altına bir çizgiyi tıklatıp sürükleyin (Ek Şekil 6). RPE kalınlığını elde etmek için Fiji ImageJ menü çubuğundaki Analiz > Ölç'e tıklayın.
    4. RPE kalınlık ölçümlerini bir elektronik tabloya aktarın ve ölçümleri içeren sütunu fare tanımlamasıyla etiketleyin. Ek bir sütunu 'İşaretli Aralık' ile etiketleyin ve optik sinir değerlerinden uzaklığı girin (örneğin, 300, 600, 900, vb.)
      NOT: İlk ölçülen aralık optik sinirden 300 μm uzaklığa, ikinci ölçülen aralık 600 μm uzağa karşılık gelir, vb.
  15. Her örnek için retina görüntülerine dayanarak RPE patoloji insidans oranlarını ölçün.
    1. Fiji ImageJ programını açın.
    2. Fiji ImageJ programında Hücre Sayacı uygulamasını açın. Fiji ImageJ menü çubuğundaki > Hücre Sayacını Analiz > Eklentiler'e tıklayın. Retinal bir görüntüyü Fiji ImageJ görev çubuğuna sürükleyin ve Hücre Sayacı penceresinde Başlat'a tıklayın.
    3. Hücre Sayacı uygulamasını kullanarak retina kesiti başına RPE patolojilerinin sayısını sayın. Sayaçlar altında Tip 1'e tıklayın ve ardından görüntüdeki tüm mikrovakuolizasyon olaylarına tıklayın. Sayaçlar altında Tür 2'ye tıklayın ve ardından görüntüdeki tüm makrovakuolizasyon olaylarına tıklayın. Sayaçlar altında Tip 3'e tıklayın ve ardından görüntüdeki tüm bireysel geçiş olaylarına tıklayın.
    4. RPE patolojilerinin numaralarını bir elektronik tabloya aktarın. Satırları mikrovakuolizasyon, makrovakuolizasyon veya migrasyon ile ve sütunu fare kimliği ile etiketleyin.
    5. Numunenin diğer görüntüleri için 1.15.2-1.15.4 arasındaki adımları yineleyin. Örnek başına RPE patolojilerinin ortalamasını alın ve elektronik tablodaki örnek için her RPE patolojisinin insidans oranını hesaplamak için beşe bölün.
  16. Çalışmadaki gruplar arasında anlamlı farklılıklar olup olmadığını belirlemek için her aralıkta RPE kalınlıkları ve RPE patoloji insidans oranları üzerinde istatistiksel analiz yapın.

2. Fare RPE'sinin transmisyon elektron mikroskobu ile değerlendirilmesi

  1. 1.5-1.9. basamaklardan sonra ortaya çıkan diğer arka segmentleri üstün işaret boyunca ikiye bölün ve tıraş bıçağı ile iki bölüme ayırın. Kesitli arka segmentlerin üst tarafını doku işaretleme boyası ile yeniden açıklamalayın. Kesitli arka segmentleri, 2 mL 1x PBS ve fare tanımlaması içeren yeni 2 mL mikrotüplere ayırın.
    NOT: Farenin arka segmenti tek parça halinde işlenemeyecek kadar büyüktür ve iletim elektron mikroskobu işlemi için ikiye bölünmelidir.
  2. Dokuları 2 mL 0.1 M kakodilat tamponu, pH 7.2 ile durulayın. Tezgah üstü RT'de 10 dakika boyunca kuluçkaya yatırın. Bu adımı iki kez daha yineleyin.
  3. 0,1 M kakodilat tamponunu, 0,1 M kakodilat tamponunda seyreltilmiş 2 mL %2 ozmiyum tetroksit (OsO4) ile değiştirin. Duman davlumbazında RT'de 1,5 saat inkübe edin.
    DİKKAT: OsO4 zehirli bir maddedir. OsO4 ile çalışırken lütfen standart çalışma prosedürlerini izleyin.
  4. Dokuları 2 mL 0.1 M kakodilat tamponu ile duman davlumbazında RT'de 10 dakika durulayın. Bu adımı bir kez tekrarlayın.
  5. Duman davlumbazındaki RT'de% 50 ila% 100 arasında değişen kademeli EtOH seyreltmeleri ile dokuları dehidrate edin. Dehidrasyon prosedürü için bir protokol Ek Şekil 7'de bulunabilir.
  6. Dokulardan% 100 EtOH çıkarın ve dokulara 2 mL propilen oksit ekleyin. RT'de duman davlumbazında 15 dakika boyunca inkübe edin. Propilen oksidi dokulardan çıkarın ve dokulara 2 mL taze propilen oksit ekleyin. RT'de duman davlumbazında 15 dakika boyunca inkübe edin.
    DİKKAT: Propilen oksit toksik bir maddedir. Lütfen propilen oksit ile çalışırken standart çalışma prosedürlerini izleyin.
  7. Propilen oksiti dokulardan çıkarın ve dokulara 2 mL'lik 1: 1 propilen oksit ve reçine karışımı ekleyin. RT'deki duman davlumbazında bir gece boyunca vakum altında bırakın.
    DİKKAT: Reçine insanlar için tehlikeli bir maddedir. Reçine ile çalışırken lütfen laboratuvarın standart çalışma prosedürlerine uyun.
  8. Dokulardaki 1: 1 propilen oksit ve reçine karışımını 2 mL saf reçine ile değiştirin. RT'deki duman davlumbazında bir gece boyunca vakum altında bırakın.
  9. Dokuları reçineye gömün. Kaleme fare kimliği olan bir etiket ve kalıba bir damla reçine yerleştirin. Dokuyu reçine damlasına yerleştirin. Kalıbı reçine ile doldurun ve duman davlumbazında RT'de 1 saat boyunca vakum altına yerleştirin.
  10. Etiketleri ve numuneleri ince uçlu forsepslerle, arka vizör adaptörü bölümünün arka tarafı üstte olacak şekilde yeniden konumlandırın. Kalıbı gece boyunca 65 °C'de duman davlumbazındaki bir fırında bırakın.
  11. Kalıpları fırından çıkarın. Kalıpların tezgah üstünde RT'ye soğumasını bekleyin. Blokları kalıplardan çıkarın.
    NOT: Bloklar artık kırpmaya hazırdır.
  12. Bir yamuk oluşturmak için reçine bloklarını bir tıraş bıçağı ile şekillendirin. Optik sinir kafası görünene kadar reçine bloklarını bir mikrotom kullanarak kesin. Reçine bloklarından 0,5 μm kalınlığında yarı ince kesitler kesmek için bir elmas bıçak kullanmaya devam edin.
    NOT: İşte mikrotom kesitleme27 ile ilgili yayınlanmış bir protokol. İstenirse, numunenin bütünlüğünü değerlendirmek için reçine bloklarından 0,5 μm kalınlığında yarı ince kesitler toplanabilir ve boyanabilir.
  13. Bir ultramikrotom kullanarak her kesilmiş bloktan 70 nm kalınlığında ultra ince bir bölüm kesin. 400 örgülü ince çubuklu bakır ızgara üzerinde 70 nm kalınlığında ultra ince bir bölüm toplayın. Izgarayı bir ızgara depolama kutusuna yerleştirin ve yuvayı fare tanımlamasıyla etiketleyin.
    NOT: İşte ultramikrotom kesitleme28 ile ilgili yayınlanmış bir protokol.
  14. Izgaraları 5 dakika boyunca% 2 uranil asetat ile ve daha sonra duman davlumbazındaki RT'de 5 dakika boyunca% 3.5 kurşun sitrat çözeltisi ile lekeleyin.
    DİKKAT: Uranil asetat ve kurşun sitrat tehlikeli maddelerdir. Lütfen bu maddelerle çalışırken standart çalışma prosedürlerini izleyin.
  15. Bakır ızgaranın ızgara çizgilerinin RPE ve BrM ile kesiştiği 15.000x büyütmede bir iletim elektron mikroskobu kullanarak her numune için görüntüler elde edin.
    NOT: Bölüm başına en az 20 ila 35 resim ve örnek başına 40 ila 70 resim olmalıdır.
  16. Çalışmadaki örnekler için görüntülerdeki BLamD yüksekliklerini ölçün.
    1. Fiji ImageJ programını açın. Örnek bölümdeki tüm görüntüleri Fiji ImageJ görev çubuğuna sürükleyin. Görüntülerin piksel cinsinden değil, μm cinsinden kalibre edildiğinden emin olun.
    2. Görüntülerdeki BLamD yüksekliğini ölçün. Fiji ImageJ görev çubuğundaki Düz simgesine tıklayın. BrM'nin elastik laminasından bir çizgiyi tıklayın ve görüntüdeki en yüksek tortunun üstüne sürükleyin (Ek Şekil 8). Görüntüdeki BLamD yüksekliğini elde etmek için Fiji ImageJ menü çubuğunda Analiz > Ölçü'yü tıklatın.
      NOT: Görüntüde BLamD yoksa, BrM'nin elastik laminasından RPE'nin bazal laminasına bir çizgi çizin.
    3. BLamD yüksekliklerini bir elektronik tabloya ve fare kimliğiyle etikete aktarın.
  17. Elektronik tabloda genotip başına BLamD yüksekliklerinin kümülatif frekanslarını ve fare başına BLamD yüksekliklerinin ortalamalarını hesaplayın. Çalışmadaki gruplar arasında anlamlı farklılıklar olup olmadığını belirlemek için BLamD yüksekliklerinin ortalamaları üzerinde istatistiksel analiz yapın.

3. Fare RPE'sinin konfokal mikroskopi ile değerlendirilmesi

  1. Farelerden gözleri toplayın. Fareleri adım 1.3'te açıklanan prosedüre göre ötenazi yapın. Adım 1.5'i kullanarak gözleri enükleatın. Kavisli forseps kullanarak gözleri, 2 mL 1x PBS ve fare tanımlaması ile 2 mL'lik bir mikrotüpe yerleştirin.
    NOT: Fotoreseptörlerin ve RPE apikal süreçlerinin sayısallaştırılması, konfokal mikroskopi yoluyla RPE'nin daha iyi görselleştirilmesine izin verdiğinden, fareleri karanlık adapte etmeyin.
  2. Fare arka vizör kapakları oluşturmak için fare gözlerini hemen temizleyin ve disseke edin.
    NOT: Arka vizör adaptörü, nöral retina içermediği için arka segmentten farklıdır.
    1. Gözü diseksiyon mikroskobu altında 1x PBS içeren bir Petri kabına aktarın (Ek Şekil 9A).
    2. Adım 1.8.2'de (Ek Şekil 9B) açıklandığı gibi göz küresindeki yağ ve kasları çıkarın.
    3. Göz küresinin korneasını 11 numaralı neşter bıçağı ile birleştirin. Kornea ve irisi adım 1.8.3'te ayrıntılı olarak açıklandığı gibi çıkarın (Ek Şekil 9C).
    4. İnce uçlu forsepslerle lensi dışarı çekin. İki ince uçlu forseps alın ve nöral retinayı posterior segmentten yavaşça ayırın.
    5. Arka vizör adaptöründen çıkarmak için optik sinir başındaki nöral retinayı dikkatlice kesin (Ek Şekil 9D).
    6. Arka vizör adaptörünü, fare tanımlamalı 500 μL 1x PBS içeren yeni bir 2 mL mikrotüpe yerleştirin.
  3. Arka vizör kapaklarını metanol (MeOH) ile sabitleyin (Ek Şekil 10).
    NOT: Adım 3.3'ün tamamlanması yaklaşık 2 saat 40 dakika sürer.
    1. Dokulara 500 μL MeOH ekleyin. RT'de 5 dakika boyunca 75 rpm'de bir çalkalayıcıda inkübe edin.
    2. 500 μL çözeltiyi dokulardan çıkarın ve 500 μL MeOH ekleyin. RT'de 5 dakika boyunca 75 rpm'de bir çalkalayıcıda 5 dakika boyunca inkübe edin.
    3. Tüm çözeltiyi dokulardan çıkarın ve 500 μL MeOH ekleyin. RT'de en az 2 saat boyunca 75 rpm'de bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
      NOT: Adım 3.3.3'e alternatif olarak, arka vizör adaptörü MeOH'da 4 °C'lik bir odada 75 rpm'de bir çalkalayıcı üzerinde gece boyunca inkübe edilebilir.
    4. Dokulara 500 μL 1x PBS ekleyin. RT'de 5 dakika boyunca 75 rpm'de bir çalkalayıcıda inkübe edin.
    5. 500 μL çözeltiyi dokulardan çıkarın ve 500 μL 1x PBS ekleyin. RT'de 5 dakika boyunca 75 rpm'de bir çalkalayıcıda inkübe edin.
    6. Tüm çözeltiyi dokulardan çıkarın ve 500 μL 1x PBS ile değiştirin.
      NOT: Mendiller MeOH tarafından tamamen sabitlenir ve en az 1 ay boyunca 4 °C'lik bir buzdolabında saklanabilir.
  4. RPE'nin sıkı bağlantılarını ve çekirdeklerini görselleştirmek için arka vizörlerin immünofloresan boyamasını yapın (Ek Şekil 11).
    1. 500 μL 1x PBS'yi numunelerden çıkarın ve 1x PBS çözeltisine 100 μL seyreltilmiş% 10 normal eşek serumu ekleyin. RT'de 30 dakika boyunca 75 rpm'de bir çalkalayıcıda inkübe edin.
    2. Seyreltilmiş% 10 normal eşek serumu çözeltisini numunelerden çıkarın ve 1x PBS'de bir tavşan poliklonal anti-Zonula Occludens-1 (ZO-1) antikorunun 1:50 seyreltilmesinin 100 μL'sini ekleyin. Numuneleri 4 ° C'lik bir odaya aktarın ve 75 rpm'de bir çalkalayıcıda gece boyunca inkübe edin.
    3. Antikor seyreltmesini numunelerden çıkarın ve 2 mL 1x PBS ekleyin. RT'de 10 dakika boyunca 75 rpm'de bir çalkalayıcıda inkübe edin.
    4. 1x PBS'yi örneklerden çıkarın. Numunelere, 488 florofor konjuge etiketli bir eşek anti-tavşan IgG antikorunun 1:250 seyreltilmesinin 100 μL'sini ve 1x PBS'de 4',6-Diamidin-2'-fenilindol dihidroklorürün (DAPI) 1:250 seyreltilmesini ekleyin. Numuneleri alüminyum folyo ile örtün ve RT'de 2 saat boyunca 75 rpm'de bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
      NOT: Fotobeyazlatmayı önlemek için numuneler tamamen alüminyum folyo ile kaplanmalıdır.
    5. Antikor ve DAPI seyreltmelerini numunelerden çıkarın. Numunelere 2 mL 1x PBS ekleyin, alüminyum folyo ile tekrar örtün ve RT'de 10 dakika boyunca 75 rpm'de bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
      NOT: RPE'nin sıkı bağlantıları ve çekirdekleri artık sırasıyla tamamen etiketlenmiş ve boyanmıştır.
  5. Arka vizör kapaklarını mikroskop slaytlarına monte edin.
    1. Bir mikroskop slaytını fare kimliğiyle etiketleyin. Arka vizör adaptörünü, koroidal tarafı aşağı bakacak şekilde diseksiyon mikroskobu altındaki bir mikroskop slaydına aktarın. Kurumasını önlemek için arka vizör adaptörüne 1x PBS damla ekleyin (Ek Şekil 12).
    2. Arka vizör adaptörünü, kardinal yönlere (yani kuzey, doğu, güney ve batı) karşılık gelen dört kadran verecek dört noktada 11 numaralı bir neşter bıçağı kullanarak kesin. Arka vizör adaptörünün çevresinden doku ile fazla 1x PBS dab. Arka vizör adaptörünü bir deve kılı fırçası ve ince uçlu forseps ile hafifçe düzleştirin (Ek Şekil 12).
      NOT: Elde edilen ürün artık RPE düz montajı olarak bilinir.
    3. RPE düz montajına bir damla montaj ortamı ekleyin ve üzerine bir kapak kayması yerleştirin. Kapak kapağını kapatmak için şeffaf tırnak cilası uygulayın ve kapalı bir çekmecede RT'de en az 30 dakika kurumasını bekleyin. Slaytları bir slayt taşıyıcı kutusuna yerleştirin ve kutuyu 4 °C buzdolabında saklayın.
      NOT: RPE düz montajına kabarcık bulaşmasını önlemeye dikkat edin. RPE düz montajları 2 haftalık bir zaman dilimi içinde görüntülenebilir.
  6. RPE düz montajının optik sinirini çevreleyen dört kadrandan her birinin görüntüsünü, her numune için 20x büyütmede konfokal bir mikroskopta elde edin. RPE düz montaj görüntüsünün bir örneği Ek Şekil 13A'da bulunabilir.
    NOT: RPE düz montajının boyutsal farklılıklarını telafi etmek için birden fazla görüntünün alındığı ve istiflendiği RPE düz montajlarının z-stack görüntülemesinin yapılması gerekebilir.
  7. Her RPE düz bağlama görüntüsündeki RPE hücrelerinin sıkı birleşimlerini izleyin. İzlenen RPE düz montaj görüntüsünün bir örneği Ek Şekil 13B'de bulunabilir.
    1. Fiji ImageJ programını açın. RPE düz bağlama görüntüsünü Fiji ImageJ görev çubuğuna sürükleyin. Görüntünün piksel cinsinden değil, mikrometre cinsinden kalibre edildiğini doğrulayın.
    2. Fırça genişliğini 3, saydamlığı 0 ve rengi kırmızı olarak ayarlamak için Fiji ImageJ görev çubuğundaki Bindirme Fırçası Aracı simgesine çift tıklayın. Overlay Brush Tool (Bindirme Fırçası Aracı) penceresindeki Close (Kapat) düğmesini tıklatın.
    3. Bindirme Fırçası Aracı simgesine tıklayın. Tamamen görüntünün içinde bulunan tüm RPE hücrelerinin dar birleşimlerini tıklatın ve sürükleyin.
      NOT: Bir izleme hatası yapılması durumunda, izleme hatasını görüntüden kaldırmak için Bindirme Fırçası Aracı simgesini çift tıklatın ve Kaplama Fırçası Aracı penceresindeki Geri Al kutusunu tıklatın.
    4. Fiji ImageJ görev çubuğundaki Dikdörtgen simgesini tıklatın. Resmin üzerine tıklayın ve görüntünün çevresini sürükleyin. İzlenen çizgileri korumak ve görüntüdeki mavi ve yeşil renkleri kaldırmak için Fiji ImageJ menü çubuğunda Düzenle > Temizle'yi tıklatın.
    5. İzleme görüntüsünü fare kimliği, kadran konumu (yani kuzey, güney, doğu veya batı) ve CP sonek etiketi ile uygun bir konuma kaydedin.
      NOT: Adım 3.7.4'ü tamamlamadan RPE izleme görüntüsünü kaydetmeyin.
  8. Her örnek için RPE hücre alanlarını hesaplayın.
    1. Bilgisayar masaüstü ekranında bir klasör oluşturarak RPE alan analizinden dosyaları kaydetmek için bir konum belirleyin. Her RPE izleme görüntüsü için alt klasörler oluşturun ve alt klasörleri fare kimliğinin yanı sıra çeyrek konumuyla (yani kuzey, güney, doğu veya batı) etiketleyin.
    2. Hücre Profil Oluşturucu programı29'u yükleyin ve açın. Ikeda_RPE Area Calculator.cpproj (Ek Kodlama Dosyası 1) proje dosyasını indirin. Hücre Profili Oluşturucu program menü çubuğunda Dosya > Proje Aç'ı tıklatarak Ikeda_RPE Alanı Hesaplayıcısı.cpproj dosyasını açın.
    3. Bir RPE izleme görüntüsünü Görüntü içine sürükleyin > Hücre Profili Oluşturucu program penceresindeki Dosya ve Klasörleri Buraya Bırakın kutusu.
    4. RPE izleme görüntüsüne karşılık gelen Cell Profiler programına klasörün konumunu girin. Hücre Profil Oluşturucu program penceresinin sol alt köşesindeki Çıktı Ayarları düğmesine tıklayın ve klasörün konumunu Varsayılan Giriş Klasörü ve Varsayılan Çıktı Klasörü metin kutularına girin.
    5. Cell Profiler program penceresinin sol alt köşesindeki Görüntüleri Analiz Et düğmesine tıklayın. Analiz tamamlandıktan sonra, ekranda bir Analiz Tamamlandı penceresi görünecektir. Analiz Tamamlandı penceresindeki Tamam düğmesine tıklayın.
      NOT: Bu eylem bir csv dosyası ve jpeg görüntüsü oluşturur. CSV dosyası, izleme görüntüsü içindeki RPE hücrelerinin alanlarını içerir. jpeg görüntüsü, her RPE hücresinin bir sayı ile etiketleneceği RPE izleme görüntüsüne karşılık gelir (Ek Şekil 13C).
    6. RPE alanlarını csv dosyasından bir elektronik tabloya aktarın. Elektronik tabloyu fare kimliğiyle etiketleyin.
    7. CSV dosyasındaki her RPE alanının jpeg görüntüsündeki tam olarak izlenen bir RPE hücresine bağlandığını doğrulayarak verilerin kalite kontrol anketini gerçekleştirin. Elektronik tablodan, tam olarak izlenen RPE hücrelerine karşılık gelmeyen değerleri kaldırın.
    8. Hücre Profili Oluşturucu programına dönün. Dosya ve Klasörleri Buraya Bırak kutusunda RPE izleme görüntüsü adına sağ tıklayın ve görüntüyü Hücre Profili Oluşturucu programından kaldırmak için Listeyi Temizle'yi seçin.
    9. Örneğin kalan üç RPE izleme görüntüsünün RPE boyutlarını hesaplamak için 3.8.3-3.8.8 arasındaki adımları yineleyin.
  9. Elektronik tablodaki her örnek için RPE hücre boyutu ortalamalarını ölçün.
  10. Elektronik tablodaki her örnek için RPE hücre yoğunluklarını ölçün. RPE hücre yoğunluğunu hesaplamak için, kadran başına RPE hücrelerinin toplam sayısını, Hücre Profili Oluşturucu programı tarafından algılanan kadran başına RPE hücrelerinin toplam alanına bölün. RPE hücre yoğunluklarının ortalamasını numune başına dört kadrandan belirleyin.
  11. Her örnek için RPE düz montajı başına çok çekirdekli RPE hücrelerinin sayısını ölçün. Numunenin dört çeyreğinde üçten fazla çekirdeğe sahip RPE hücrelerinin sayısını saymak için 1.15.1-1.15.3 adımlarında açıklandığı gibi Fiji ImageJ programındaki Hücre Sayacı uygulamasını kullanın.
  12. Çalışmada gruplar arasında anlamlı farklılıklar olup olmadığını belirlemek için RPE hücre boyutu ve yoğunluk ortalamalarının yanı sıra çok çekirdekli RPE hücrelerinin sayısı üzerinde istatistiksel analiz yapın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu makalede açıklanan RPE fenotipleme protokolünün tamamlanması, AMD'nin fare modellerinde yaygın olarak gözlenen yapısal RPE anormalliklerinin nicel bir analizini sağlar. Bu protokolün etkinliğini doğrulamak için, tavuk beta-aktin promotörü (Tmem135 TG)30 ve yaşlı C57BL / 6J fareleri31,32 tarafından tahrik edilen WT Tmem135'i aşırı eksprese eden transgenik fareler de dahil olmak üzere RPE patolojileri gösterdiği bilinen farelerde kullandık. Bu deneylerin amacı, bu protokolde açıklanan yöntemler kullanılarak elde edilebilecek temsili sonuçları, fare modellerinde yeni olan araştırmacılara göstermektir.

Işık mikroskobu kullanarak RPE patolojilerini değerlendirmek için WT ve Tmem135 TG farelerinden gelen gözleri işlemek ve değerlendirmek için protokolün 1. Adımındaki yöntemlere bağlı kaldık. 4 aylık Tmem135 TG farelerinin, post-hoc Tukey testi ile bir ANOVA aracılığıyla yaşa uygun WT'ye göre ölçülen iki aralıkta RPE kalınlığında anlamlı bir azalmaya sahip olduğunu bulduk (Şekil 4). Bu sonuçlar, RPE'nin 4 aylık Tmem135 TG farelerinde, optik sinirden 600 ve 900 μm uzaklıktaki yaşa uygun WT farelerinden daha ince olduğunu göstermektedir.

Ek olarak, protokolün Adım 1 yöntemlerini kullanarak, üç 25 günlük WT ve Tmem135 TG faresinin mikrovakuolizasyonu, makrovakuolizasyonu ve göçü dahil olmak üzere RPE patolojilerinin insidansını hesapladık (Şekil 5A). WT farelerde slayt başına RPE mikrovakuolizasyon patolojilerinin ortalama sıklığı 0.67 ± 0.31 ve Tmem135 TG farelerde 7.07 ± 0.61 idi (Şekil 5B). WT farelerde RPE makrovakuolizasyonu yoktu, ancak Tmem135 TG farelerinde ortalama 5.33 ± 2.02 makrovakuolizasyon olayı vardı (Şekil 5C). Son olarak, slayt başına göçmen RPE hücrelerinin oranları WT farelerde sıfır, Tmem135 TG farelerinde 0.4 ± 0.35 idi (Şekil 5D). Bir öğrencinin t-testini yaptıktan sonra, RPE mikrovakuolizasyonu ve mikrovakuolizasyon insidansı, WT ve Tmem135 TG fareleri arasında anlamlı derecede farklıydı. Bununla birlikte, Tmem135 TG farelerde RPE göçmen hücrelerinin daha yüksek insidansı, WT'ye kıyasla anlamlı olarak farklı değildi (p = 0.1161). Bu veriler, RPE mikrovakuolizasyonu ve makrovakuolizasyonunun, ancak göçün değil, 25 günlük Tmem135 TG'de WT farelerinden anlamlı derecede daha yüksek olduğunu göstermektedir.

Adım 2'de yer alan protokol yöntemlerini takiben, BLamD'lerin varlığını ve yüksekliklerini analiz etmek için transmisyon elektron mikroskobu için 2 aylık ve 24 aylık WT C57BL / 6J farelerden retina kesitleri hazırladık. BLamD'lerin 24 aylık WT retinalarında mevcut olduğunu, 2 aylık WT retinalarında özellikle bulunmadığını tespit ettik (Şekil 6A). 24 aylık WT retinalarındaki BLamD'lerin yüksekliklerini, oluşumlarının kümülatif frekanslarını hesaplayarak ve çizerek sunduk. BLamD yüksekliklerinin kümülatif frekansları, tortu yüksekliklerinin dağılımını göstermek için tortu yüksekliğine karşı grafiklendirilmiştir. 24 aylık WT BLamD yükseklikleri için çizginin sağında, 2 aylık WT BLamD yüksekliklerine kıyasla bir kayma vardır ve bu da 24 aylık WT farelerinde birikintilerin arttığını göstermektedir (Şekil 6B). Bu grafik, 24 aylık WT retinalarında (1.01 μm ± 0.43 μm) BLamD yüksekliklerinin, bir öğrencinin t-testi ile anlamlı derecede farklı olan 2 aylık WT retinalarından (0.23 μm ± 0.017 μm) daha büyük bir ortalaması ile desteklenmektedir (Şekil 6C). Özetle, 24 aylık WT farelerinin, 2 aylık WT farelerine kıyasla retinalarının alt RPE boşluğunda büyük BLamD'lere sahip olduğu sonucuna vardık.

RPE dismorfisi ve multinükleasyonun tespiti ve analizi için RPE düz montajları oluşturmak üzere Adım 3'te 4 aylık WT ve Tmem135 TG farelerinden göz hazırlama yöntemlerini uyguladık. Bu protokolde, RPE dismorfisini bir AMD fare modelinde RPE hücre boyutu ve yoğunluğundaki kontrollere göre değişikliklerle tanımladık. 4 aylık Tmem135 TG farelerde RPE'nin dismorfik olduğunu bulduk (Şekil 7A). Tmem135 TG retinalarındaki RPE, yaşa uygun WT retinalarından daha büyüktür (806.89 μm 2 ± 252.67'ye karşı 291.69 μm 2 ± 26.31) ve daha az yoğundur (0.0014 hücre/μm 2 ± 0.00039'a karşı 0.0033 hücre/μm 2 ± 0.00024). Ayrıca, Tmem135 TG retinalarında WT kontrollerine kıyasla daha fazla çok çekirdekli RPE hücresi vardı (8.04 hücre ± 5.54 hücreye karşılık 0.29 hücreye ±) (Şekil 7D). Tüm bu parametreler öğrencinin t-testi ile istatistiksel anlamlılığa ulaşmıştır. Birlikte, 4 aylık Tmem135 TG fareleri, 4 aylık WT farelerinden daha fazla dismorfik ve çok çekirdekli RPE hücrelerine sahiptir.

Figure 1
Resim 1: Işık mikroskobu ile saptanan RPE patolojileri. WT (A) farelerinde normal RPE ve Tmem135 TG farelerde (B-E) anormal RPE'nin temsili görüntüleri. Tmem135 TG farelerde gözlenen RPE patolojileri RPE incelmesi (B), makrovakuolizasyon (C), mikrovakuolizasyon (D) ve migrasyonu (E) içerir. Her patoloji siyah bir okla gösterilmiştir. Ölçek çubuğu = 100 μm. Büyütme = 20x. Kısaltmalar: RGC = retinal ganglion hücre tabakası, IPL = iç pleksiform tabaka, INL = iç nükleer tabaka, OPL = dış pleksiform tabaka, ONL = dış nükleer tabaka, IS = fotoreseptör iç segmentleri, OS = fotoreseptör dış segmentleri, RPE = retinal pigmentli epitel, Cho = koroid. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: İletim elektron mikroskobu ile saptanan RPE patolojileri. Genç CFH-H/H ve (B) bol miktarda bazal laminer birikintiye (BLamD) sahip 2 yaşındaki CFH-H/H farelerde (A) RPE'nin temsili görüntüleri. BLamD'ler görüntüde sarı noktalarla izlenir. Ölçek çubuğu = 800 nm. Büyütme = 15.000x. Kısaltmalar: N = çekirdek, M = mitokondri, P = pigment granül, BI = bazal kıvrımlar, EL = elastik lamina, RPE = retinal pigmentli epitel, BrM = Bruch zarı, Cho = koroid. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Konfokal mikroskopi ile saptanan RPE patolojileri. (A) 8 aylık WT'nin normal RPE'sinin ve (B) RPE dismorfisi sergileyen 8 aylık Tmem135 TG farelerinin anormal RPE'sinin temsili görüntüleri. Beyaz kare, üç çekirdekli çok çekirdekli bir RPE hücresini tasvir etmek için (C) yakınlaştırılır. Yeşil renk anti-ZO1 ilişkili RPE sıkı kavşaklarıdır ve mavi renk RPE çekirdeklerinin DAPI boyamasıdır. Ölçek çubuğu = 50 μm. Büyütme = 20x. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Resim 4: 4 aylık vahşi tip (WT) ve Tmem135 TG farelerde RPE kalınlığı. (A) 4 aylık WT ve Tmem135 TG (TG) farelerinden retinanın temsili görüntüleri. Büyütme = 20x. Ölçek çubuğu = 100 μm. (B) Optik sinirden 3.000 μm uzağa kadar 4 aylık WT (siyah) ve Tmem135 TG farelerinde (yeşil) RPE kalınlık ölçümlerinin çizgi grafikleri. Genotipten sonraki sayılar bu çalışmada kullanılan farelerin sayısını gösterir. *p < 0.05, post-hoc Tukey testi ile ANOVA. Tüm veriler ortalama ± sd'dir. Retina tabakalarının kısaltmaları için lütfen Şekil 1 açıklamasına bakın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: 25 günlük Tmem135 TG farelerde RPE patolojileri. (A) Üç adet 25 günlük Tmem135 TG (TG) farede RPE mikrovakuolizasyonu, makrovakuolizasyonu ve migrasyonun temsili görüntüleri. RPE patolojileri her görüntüde siyah oklarla vurgulanır. Büyütme = 40x. Ölçek çubuğu = 20 μm. (B-D) RPE mikro ve makrovakuolizasyonun yanı sıra 25 günlük WT ve Tmem135 TG farelerde göçmen RPE hücrelerinin miktarının belirlenmesi. Parantez içindeki sayılar, bu çalışmada kullanılan farelerin sayısını gösterir. *p < 0.05 ve ****p < 0.0001, öğrencinin t-testi. Tüm veriler ortalama ± sd'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Genç ve yaşlı WT retinalarında BLamD'lerin ultrayapısal analizi . (A) 2 aylık ve 24 aylık WT RPE'nin temsili elektron mikrografileri. Büyütme = 15.000x. Ölçek çubuğu = 800 nm. Bazal laminer tortu (BLamD) örneği bir braket ile diyagramlandırılmıştır. (B) BLamD yüksekliklerinin kümülatif frekansları. (C) BLamD yükseklik ortalamaları. Parantez içindeki sayılar, bu çalışmada kullanılan genotip başına toplam fare sayısını gösterir. **P < 0.01, öğrencinin t-testi. Tüm veriler ortalama ± sd'dir. Retina tabakalarının kısaltmaları için lütfen Şekil 2 açıklamasına bakınız. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: RPE düz montajları, Tmem135 TG farelerde RPE patolojilerini ortaya koymaktadır. (A) 4 aylık WT ve Tmem135 TG (TG) RPE düz montajlarının, yeşil renkte anti-ZO-1 ve mavi renkte DAPI içeren temsili görüntüleri. Büyütme = 20x. Ölçek çubuğu = 100 μm. (B) RPE hücre boyutu, (C) RPE hücre yoğunluğu ve (D) 4 aylık WT ve Tmem135 TG farelerde RPE çoklu çekirdeklenmesi. Parantez içindeki sayı, çalışmada kullanılan farelerin sayısını gösterir. *p < 0.05, **p < 0.01 ve ****p < 0.0001, öğrencinin t-testi. Tüm veriler sd ± ortalamadır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Kardiyak perfüzyon kurulumu ve kullanımının şeması. (A) Yerçekimi beslemeli perfüzyon sistemi. (B) Fiksatif tampon için perfüzyon sisteminin şırınga namlusu. (C) Tamponun boru hattından akmasına izin vermek için boru hattına paralel olana kadar döndürülecek valf. (D) Tamponun boru hattına akmasını durdurmak için boru hattı ile dik olana kadar döndürülecek valf. Biorender'da oluşturulan görüntü. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: Bir farenin kardiyak perfüzyonu için prosedür şeması. (A) Karın boşluğunu açığa çıkarmak için yapılan dört insizyon. (B) Kalbi açığa çıkarmak için diyafram ve sternumdan yapılan kesim. (C) Kalbin sol ventrikülüne yerleştirilen ölçüm iğnesi. Vana, boru hattına paralel olana kadar döndürülür. Sağ atriyum, kanın ve fiksatifin çıkmasına izin vermek için kavisli makasla kesilir. Biorender'da oluşturulan görüntü. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 3: Bir fareden gözleri enüklee etmek için prosedür şeması. (A) Gözün göz yuvasından çıkıntısına neden olmak için başparmak ve işaret parmağınızla göz yuvasının etrafına hafifçe bastırın. (B) Kavisli makas alın ve bıçakla göz yuvasından 30° açıyla tutun. Kavisli makasla göz çevresini 30° açıyla kesmeye devam edin. Renkli noktalar, farenin veya kavisli makasın üzerindeki parmak yerleşimini temsil eder. Biorender'da oluşturulan görüntü. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 4: Fare arka segmentini vermek için fare gözü diseksiyonunun resimleri. (A) Göz, diseksiyon mikroskobuna aktarılır. (B) Göz küresinden çıkarılan yağ ve kas. (C) Kornea ve iris göz küresinden çıkarılır. (D) Lens göz küresinden çıkarıldı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 5: Hematoksilin eozin (H&E) boyama prosedürü. Parafine gömülü retina kesitlerini boyamak için H&E prosedürünü gösteren şematik. Oklar, adımlar arasındaki aktarımı gösterir. Her adımın zamanı kırmızı yazı tipinde verilir. Boyama için reaktifler, cam boyama kapları içinde siyah yazı tipinde sağlanır. Yukarıdaki şemada yer alan her reaktif için hazırlanmış bir cam boyama kabı bulunmalıdır. Tüm adımlar bir duman davlumbazında tamamlanmalıdır. Bir slayta kapak kapağı eklerken, slayda kabarcık sokmamaya dikkat edin. Prosedürün tamamlanmasından sonra, slaytlar bir slayt kutusunda saklanabilir. Biorender'da oluşturulan görüntü. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 6: RPE kalınlık ölçümü örneği. Siyah ok, RPE'nin üstünden altına doğru kırmızı bir çizgiyi gösterir. Bu çizgi, RPE'nin kalınlığını belirlemek için ölçülebilir. Ölçek çubuğu = 100 μm. Büyütme = 20x. RPE'nin daha kolay görüntülenmesi için kutulu alan uzaklaştırılır. Retina tabakalarının kısaltmaları için lütfen Şekil 1 açıklamasına bakın. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 7: TEM işleme için fare arka segmentlerinin EtOH dehidrasyon prosedürü. Biorender'da oluşturulan görüntü. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 8: BLamD yükseklik ölçümü örneği. Kırmızı çizgi, bu görüntüdeki en büyük BLamD'yi göstermektedir. Sarı noktalar görüntüdeki BLamD'leri tanımlar. Bu kırmızı çizgi, bu görüntüdeki BLamD'nin yüksekliğini belirlemek için ölçülebilir. Ölçek çubuğu = 800 nm. Büyütme = 15.000x. Retina tabakalarının kısaltmaları için lütfen Şekil 2 açıklamasına bakınız. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 9: RPE düz montajı için fare gözü diseksiyonu. (A) Göz, diseksiyon mikroskobu altında 1x PBS içeren bir Petri kabına aktarılır. (B) Göz küresinden çıkarılan yağ ve kas. (C) Kornea ve iris göz küresinden çıkarılır. (D) Göz küresinden çıkarılan lens ve retina. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 10: Fare arka göz kapaklarının metanol (MeOH) fiksasyon prosedürü. Biorender'da oluşturulan görüntü. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 11: RPE hücrelerinin sıkı bağlantılarını ve çekirdeklerini etiketlemek için immünofloresan prosedürü. Bu protokolden immünofloresan tekniğinin adımlarını gösteren diyagram. Not Bu tekniğin tamamlanması 2 gün sürer. Tüm adımlar, diyagramda özellikle belirtilmediği sürece, RT'de ve 75 rpm hızında bir çalkalayıcıda gerçekleşir. Bu çalışmada kullanılan primer (1°) antikor tavşan poliklonal anti-ZO1 ve bu çalışmada kullanılan sekonder (2º) antikor 488 florofor konjuge eşek anti-tavşan IgG idi. Numunelere ikincil antikor ve DAPI eklendikten sonra, numunenin fotobeyazlatılmasına karşı korunmak için numuneler alüminyum folyoya sarılmalıdır. Biorender'da oluşturulan görüntü. Kısaltmalar: NDS = normal eşek serumu, Ab = antikor. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 12: Dört kadranlık fare RPE düz montajı elde etmek için kesimlerin tasviri. N = kuzey, E = doğu, S = güney, W = batı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 13: RPE düz bağlama analizi uç noktalarına örnekler. (A) RPE düz montaj görüntüsü. (B) RPE sınır izleme görüntüsü. (C) RPE Hücre Profilcisi analiz edilen görüntü. Büyütme = 20x. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Kodlama Dosyası 1: Ikeda RPE Area Calculator.cpproj Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu yazıda, fare modellerinin yapısal RPE patolojilerini değerlendirmek için bir fenotipleme protokolü tanıtıldı. Işık, transmisyon elektronu ve konfokal mikroskopi dahil olmak üzere çeşitli görüntüleme teknikleri için gözlerin işlenmesi için gerekli adımları ve bu görüntüleme yöntemleriyle gözlenen tipik patolojilerin nicelleştirilmesini tanımladık. RPE fenotipleme protokolümüzün etkinliğini, Tmem135 TG ve 24 aylık WT farelerini inceleyerek kanıtladık, çünkü bu fareler RPE patolojilerini30,31,32 gösteriyor. Bu protokol, RPE incelmesi, vakuolizasyon, migrasyon ve dismorfi gibi RPE patolojilerini ve BLamDs 6,7'yi barındırabilen genetiği değiştirilmiş veya farmakolojik olarak tedavi edilmiş herhangi bir fareye uygulanabilir. Tmem135 TG ve 24 aylık WT farelerde gözlenen RPE patolojileri diğer AMDfare modellerinde 7,30 mevcut olsa da, AMD fare modelinin RPE patolojilerinin başlangıç yaşı ve ciddiyeti Tmem135'ten farklı olabileceğinden, araştırmacının çalışmaları için seçilen AMD fare modeline aşina olması önemlidirTG ve 24 aylık WT fareleri. Araştırmacıların, RPE patolojilerinin sunumu kendi AMD fare modellerinde değişkense, çalışmaları için bu makalede gösterilen temsili sonuçları üretmek için kullanılan fare sayısından daha fazla fare kullanmaları gerekebilir. Ayrıca, birçok AMD fare modeli şu anda AMD araştırmacıları tarafından kullanılabilir, ancak RPE patolojilerinin tam açıklamalarına sahip değildir, bu da araştırmacıların bu bilgileri elde etmek için ön çalışmalar yapmalarını gerektirebilir.

Çeşitli görüntüleme yöntemleri için fare gözlerinin nasıl işlendiği konusunda değişiklikler yapılabilse de, protokolde açıklandığı gibi yapısal RPE anormalliklerinin kantitatif değerlendirmesini sürdürmek kritik öneme sahiptir. Örneğin, RPE mikrovakuolizasyonu, makrovakuolizasyon ve migrasyon olaylarının sayısını saymak için beş H &E boyalı retina bölümü hazırlandı ve araştırmacıların RPE patolojilerini fare retinasında birden fazla yerde değerlendirmelerine izin verildi. Başka bir örnek, RPE'nin ultrayapısal anormalliklerini değerlendirmek için 400 örgülü ince çubuklu bir bakır elektron mikroskopi ızgarası kullanmaktır. Elektron mikroskobu ızgarası, bir retina örneğini iletim elektron mikrografisi ile sistematik ve tarafsız bir şekilde değerlendirmek ve BLamD'lerin varlığını incelemek için retinal bölüm başına 40 ila 70 görüntü elde etmek için bir çerçeve sağlar. Bu, bir elektron mikroskobu-slot ızgarası ile elde edilemez ve bunları bu protokolle kullanmamanızı öneririz. Son olarak, bir RPE düz montajının dört çeyreğinden 20x büyütme görüntüleri yakalamak, araştırmacıların dismorfi ve çoklu çekirdeklenme için geniş murin RPE alanlarını araştırmalarını sağlar. Araştırmacılar bu protokolü genişletmekte ve çalışmalarında RPE patolojileri için ek retina bölümlerini incelemekte özgürdürler. Birlikte, bu yöntemler araştırmacıların AMD fare modellerinde bulunabilecek yapısal RPE patolojileri hakkında sonuçlar çıkarmak için yeterli veri toplamasına olanak tanır.

Bu protokolün bir diğer önemli özelliği RPE fenotipleme yöntemlerinin tutarlılığıdır. Örneğin, ışık ve iletim elektron mikroskobu için kullanılan tüm gözler, kesitleme için fare retinasının üst tarafı tarafından yönlendirildi. Işık ve iletim elektron mikroskobu için işlenmesi boyunca fare gözünün oryantasyonunu korumak önemlidir, çünkü fare gözü retina hücrelerinin topografik dağılımına sahiptir33,34. RPE düz montaj hazırlığı için fare gözünün anatomik oryantasyonu korunmamıştır, çünkü fare RPE hücresinin alt topografik değişikliklerinden daha üstün olduğu gözlenmemiştir. Aslında, insan retinasındaki RPE, optik sinir kafası35'ten uzağa yayılan topografik değişiklikler gösterir, bu da fare RPE'si için geçerli olabileceğini düşündürmektedir. Son olarak, bu protokolde açıklanan görüntü elde etme, optik sinirin anatomik konumlandırılmasına dayanır. Bu metodolojik yönlerin dahil edilmesi, AMD fare modelleriyle çalışan araştırmacılar için RPE patolojilerinin sonuçlarının çoğaltılmasına yardımcı olacaktır.

Araştırmacılar, RPE fenotipleme protokolüne daha fazla analitik özellik eklemek isteyebilirler. Bu protokolde yer almayan bazı fenotipik sonuçlar BrM kalınlığı, RPE apikal mikrovillus ve diğer RPE ultrastrüktürel bileşenlerin incelenmesidir. Bu bileşenler mitokondri, pigment granülleri ve fagozomlar gibi diğer organelleri içerir. Araştırmacılar, Fiji ImageJ programını kullanarak bu protokolle elde edilen elektron mikrograflarında bu bileşenlerin boyutunu ve sayısını belirleyebilirler. Özellikle, mitokondrinin durumu dikkate alınması gereken önemli bir fenotipik sonuç olabilir, çünkü RPE'de mitokondrinin hedeflenmesi AMD36 için önemli bir terapötik stratejidir. Diğer bir fenotipik sonuç, RPE düz montajlarında RPE dismorfisinin ek ölçümleridir. Protokol kullanılarak elde edilen RPE düz montajlı görüntüler, REShAPE programı (https://github.com/nih-nei/REShAPE)35 ile RPE altıgen şekli, komşu RPE hücrelerinin sayısı ve diğer özellikler açısından incelenebilir. Bir diğer olası fenotipik sonuç, RPE patolojilerinin fare retinasının merkezi veya periferik bölgelerinde meydana gelip gelmediğidir. Bu ek fenotipik hususlar, bu makalede açıklanan RPE fenotipleme protokolünü daha da güçlendirecektir.

Bu RPE fenotipleme protokolünün birkaç sınırlaması vardır. Bu yöntemin bir sınırlaması, RPE fenotiplemesi için gözlerini toplamak için fareleri feda etme ihtiyacıdır. Alternatif olarak, spektral alan optik koherens tomografi (SD-OCT) görüntülemedeki yeni gelişmeler, canlı farelerde RPE kalınlığının ve patolojilerinin nicelleştirilmesine olanak sağlamaktadır37-39. Bu, AMD fare modeli kohortları üzerinde uzunlamasına çalışmalar yapmak isteyen araştırmacılar için avantajlı olabilir. Bu yöntemin bir başka sınırlaması, farelerde fonksiyonel RPE değerlendirmelerinin olmamasıdır. Araştırmacılar farelerde RPE'nin fonksiyonel bir değerlendirmesiyle ilgileniyorlarsa, elektroretinografi yapılmasını ve c-dalgası bileşeninin ölçülmesini öneririz, çünkü c-dalgası RPE'nin fototransdüksiyon40'taki fonksiyonel rolünün göstergesidir. Bu yöntemin bir başka sınırlaması, farelerde RPE belirteçlerinin biyokimyasal ölçümlerinin olmamasıdır. Araştırmacılar, hücresel retinaldehit bağlayıcı protein (CRABLP), retinal pigment epiteline özgü 65 kDa proteini (RPE65), potasyum içe doğru doğrultucu kanal alt ailesi J üyesi 13 (KCNJ13) veya bestrofin 1 (BEST1) gibi RPE belirteçlerinin seviyelerini araştırmak isterlerse, immünohistokimya, kantitatif gerçek zamanlı PCR veya batı leke analizi için gözlerin toplanmasını öneririz.

Sonuç olarak, bu RPE fenotipleme protokolü, AMD'nin patolojik yönlerini özetleyen fare modellerini kullanan araştırmacılar için önemli bir kaynak olabilir. Bu protokol aynı zamanda literatürde daha önce tanımlanmamış olan AMD fare modellerinde RPE'nin nasıl değerlendirildiğini standartlaştırmaya da hizmet eder. RPE fenotiplemesinin standartlaştırılması, bulguların farelerden RPE hücre kültürü modelleri4 ve insan olmayan primatlar da dahil olmak üzere daha yüksek organizma modelleri de dahil olmak üzere diğer AMD modellerine çevrilmesinde kritik öneme sahip olacaktır. Ayrıca, AMD gelişiminin altında yatan patobiyolojik mekanizmaları anlamamıza ve bu kör edici hastalık için potansiyel olarak yeni tedaviler geliştirmemize yardımcı olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Bu protokolün yazarlarının hiçbir açıklaması ve çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgments

Yazarlar, dokularımızı ışık mikroskobu için hazırladıkları için Satoshi Kinoshita ve Wisconsin Üniversitesi (UW) Patolojide Translasyonel Araştırma Girişimleri laboratuvarına (TRIP) teşekkür etmek ister. Bu çekirdek, UW Patoloji ve Laboratuvar Tıbbı Bölümü, Wisconsin Üniversitesi Carbone Kanser Merkezi (P30 CA014520) ve Direktör-NIH Ofisi (S10OD023526) tarafından desteklenmektedir. Konfokal mikroskopi, UW Biyokimya Vakfı Bölümü'nün desteğiyle kurulan UW Biyokimya Optik Çekirdeği'nde gerçekleştirildi. Bu çalışma aynı zamanda Ulusal Göz Enstitüsü'nden (R01EY022086'dan A. Ikeda'ya; R01EY031748'den C. Bowes Rickman'a; P30EY016665 UW Oftalmoloji ve Görsel Bilimler Bölümüne; P30EY005722 Duke Göz Merkezi'ne; NIH T32EY027721 - M. Landowski; F32EY032766 - M. Landowski), Timothy William Alabalık Başkanlığı (A. Ikeda), FFB Free Family AMD Ödülü (C. Bowes Rickman); ve Körlüğü Önleme Araştırması'ndan (Duke Göz Merkezi) sınırsız bir hibe.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 M Cacodylate Buffer pH7.2 PolyScientiifc R&D Company S1619
100 Capacity Slide Box Two are needed for this protocol (one for H&E-stained slides and one for RPE flat mounts.)
100% Ethanol  MDS Warehouse 2292-CASE Can be used to make diluted ethanol solutions in this protocol.
1-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks Qosina 11069
1x Phosphate Buffer Solution (PBS) Premade 1x PBS can be used in this protocol. 
2.0 mL microtubes Genesee Scientific  24-283-LR
24 Cavity Embedding Capsule Substitute Mold Electron Microscopy Sciences 70165
24 inch PVC Tubing with Luer Ends Fisher Scientific NC1376778
400 Mesh Gilder Thin Bar Square Mesh Grids Electron Microscopy Sciences T400-Cu
95% Ethanol MDS Warehouse 2293-CASE
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier (23 inches by 24 inches) VWR 56616-031
Adjustable 237 ml  Spray Bottle VWR 23609-182
Alexa Fluor488 Conjugated Donkey anti-Rabbit IgG  Thermo Fisher Scientific A-21206
Aluminum Foil
BD Precision glide 19 Gauge Syringe Needle Sigma-Aldrich  Z192546
Bracken Forceps; Curved; Fine Cross Serrations; 4" Length, 1 mm Tip Width Roboz Surgical Instrument RS-5211 Known as curved forceps in this protocol.
Camel Hair Brush Electron Microscopy Sciences 65575-02
Carbon Dioxide Euthanasia Chamber
Carbon Dioxide Flow Meter
Carbon Dioxide Tank
Castaloy Prong Extension Clamps Fisher Scientific  05-769-7Q
Cast-Iron L-shaped Base Support Stand Fisher Scientific  11-474-207
Cell Prolifer Program Available to download: https://cellprofiler.org/releases
Clear Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180
Colorfrost Microscope Slides Lavender VWR 10118-956
Computer
DAPI Sigma-Aldrich D9542-5MG
Distilled H20 Water from Milli-Q Purification System was used in this protocol.
Dumont Thin Tip Tweezers; Pattern #55 Roboz Surgical Instrument RS-4984 Known as fine-tipped forceps in this protocol, and 3 are needed for this protocol (two for dissections and one for electron microscope processing).
Electron Microscopy Grid Holder Electron Microscopy Sciences 71147-01
EPON 815 Resin Electron Microscopy Sciences 14910
Epredia Mark-It Tissue Marking Yellow Dye Fisher Scientific  22050460 Please follow manufacturer's protocol when using this tissue marking dye. 
Epredia Mounting Media Fisher Scientific 22-110-610 Use for mounting H&E slides. 
Fiber-Lite Mi-150 Illuminator Series,150 w Halogen Light Source Dolan-Jenner Industries Mi-150 Light source for dissecting microscope.
Fiji ImageJ Program Available to download: https://imagej.net/downloads
Flexaframe Castaloy Hook Connector Thermo Scientific   14-666-18Q
Fume hood
Glutaraldehyde 2.5% in Phosphate Buffer, pH 7.4, 32% Electron Microscopy Sciences 16537-05
JEM-1400 Transmission Electron Microscope (JEOL) with an ORIUS (1000) CCD Camera
Laboratory Benchtop Shaker Two are needed for these experiments. One should be at room temperature while the other should be in a 4 degree Celsius cold room.
Laser Cryo Tag Labels Electron Microscopy Sciences 77564-05
Lead Citrate Electron Microscopy Sciences 17800
Leica EM UC7Ultramicrotome
Leica Reichert Ultracut S Microtome
LifterSlips Thermo Fisher Scientific 22X22I24788001LS Use these coverslips for the RPE flat mounts as they have raised edges and accommodate the thickness of the RPE.
Mayer's Hematoxylin VWR 100504-406
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors Roboz Surgical Instrument RS-5600 Known as micro-dissecting scissors in protocol. 
Methanol Fisher Scientific  A412-4
Mice Any AMD mouse model and its respective controls can work for this protocol.
Micro Dissecting Scissors; Standard Version; Curved; Sharp Points; 24 mm Blade Length; 4.5" Overall Length Roboz Surgical Instrument RS-5913 Known as curved scissors in this protocol.
Microsoft Excel
Microtube racks
Nikon A1RS Confocal Microscope
Normal Donkey Serum SouthernBiotech 0030-01
Number 11 Sterile Disposable Scalpel Blades VWR 21909-380
Osmium Tetroxide  Electron Microscopy Sciences 19150
Paraformaldehyde, 32% Electron Microscopy Sciences 15714-S
Pencil
Petri Dish VWR  21909-380
Pipette Tips
Pipettes 
Polyclonal Anti-ZO-1 Antibody Thermo Fisher Scientific 402200
Propylene Oxide Electron Microscopy Sciences 20412
Razor Blade VWR 10040-386
Shallow Tray for Mouse Perfusions
Shandon Eosin Y Alcoholic VWR 89370-828
Sharpie Ultra Fine Tip Black Permanent Marker Staples 642736
Slide Rack for Staining Grainger 49WF31
Squared Cover Glass Slips Fisher Scientific  12-541B
Staining Dish with Cover Grainger 49WF30 Need 15 for H&E staining procedure.
Target All-Plastic Disposable Luer-Slip 50 mL Syringe  Thermo Scientific  S7510-50 Use only the syringe barrel.
Timer Fisher 1464917
Uranyl Acetate Electron Microscopy Sciences 22400
Vacuum Oven
Vectashield Mounting Medium Vector Laboratories H-1000 Use for mounting RPE flat mounts. 
Xylene Fisher Scientific  22050283
Zeiss Axio Imager 2 Light Microscope This microscope has the capacity to generate stitched 20x images. If a light microscope does not have this capacity, then take images of the entire retina that are slightly overlapping each other. Use Adobe Photoshop to stitch these images together. Please refer to the manuals of the Adobe Photoshop program for image stitching. 
Zeiss Stemi 2000 Dissecting Microscope Electron Microscopy Sciences 65575-02

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet. Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).
  2. Bhutto, I., Lutty, G. Understanding age-related macular degeneration (AMD): relationships between the photoreceptor/retinal pigment epithelium/Bruch's membrane/choriocapillaris complex. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 295-317 (2012).
  3. Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progess in Retinal and Eye Research. 100846, (2020).
  4. Bharti, K., et al. Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 222, 109170 (2022).
  5. Forest, D. L., Johnson, L. V., Clegg, D. O. Cellular models and therapies for age-related macular degeneration. Disease Models & Mechanisms. 8 (5), 421-427 (2015).
  6. Landowski, M., Bowes Rickman, C. Targeting lipid metabolism for the treatment of age-related macular degeneration: Insights from preclinical mouse models. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 38 (1), 3-32 (2022).
  7. Pennesi, M. E., Neuringer, M., Courtney, R. J. Animal models of age related macular degeneration. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 487-509 (2012).
  8. Malek, G., Busik, J., Grant, M. B., Choudhary, M. Models of retinal diseases and their applicability in drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 13 (4), 359-377 (2018).
  9. Cao, D., et al. Hyperreflective foci, optical coherence tomography progression indicators in age-related macular degeneration, include transdifferentiated retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 62 (10), 34 (2021).
  10. Ding, J. D., et al. Expression of human complement factor H prevents age-related macular degeneration-like retina damage and kidney abnormalities in aged Cfh knockout mice. The American Journal of Pathology. 185 (1), 29-42 (2015).
  11. Zanzottera, E. C., et al. The project MACULA retinal pigment epithelium grading system for histology and optical coherence tomography in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 56 (5), 3253-3268 (2015).
  12. Ding, J. D., et al. Anti-amyloid therapy protects against retinal pigmented epithelium damage and vision loss in a model of age-related macular degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (28), 279-287 (2011).
  13. Zhang, Q., et al. Comparison of histologic findings in age-related macular degeneration with RPE flatmount images. Molecular Vision. 25, 70-78 (2019).
  14. vonder Emde, L., et al. Histologic cell shape descriptors for the retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: A comparison to unaffected eyes. Translational Vision Science & Technology. 11 (8), 19 (2022).
  15. Gambril, J. A., et al. Quantifying retinal pigment epithelium dysmorphia and loss of histologic autofluorescence in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 60 (7), 2481-2493 (2019).
  16. Bird, A. C., Phillips, R. L., Hageman, G. S. Geographic atrophy: a histopathological assessment. JAMA Ophthalmology. 132 (3), 338-345 (2014).
  17. Zanzottera, E. C., et al. Visualizing retinal pigment epithelium phenotypes in the transition to geographic atrophy in age-related macular degeneration. Retina. 36, 12-25 (2016).
  18. Sura, A. A., et al. Measuring the contributions of basal laminar deposit and Bruch's membrane in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 61 (13), 19 (2020).
  19. Curcio, C. A. Soft drusen in age-related macular degeneration: biology and targeting via the oil spill strategies. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 59 (4), 160 (2018).
  20. Johnson, M., et al. Comparison of morphology of human macular and peripheral Bruch's membrane in older eyes. Current Eye Research. 32 (9), 791-799 (2007).
  21. Sarks, S. H., Arnold, J. J., Killingsworth, M. C., Sarks, J. P. Early drusen formation in the normal and aging eye and their relation to age related maculopathy: a clinicopathological study. The British Journal of Ophthalmology. 83 (3), 358-368 (1999).
  22. Chen, L., Messinger, J. D., Kar, D., Duncan, J. L., Curcio, C. A. Biometrics, impact, and significance of basal linear deposit and subretinal drusenoid deposit in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 62 (1), 33 (2021).
  23. Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).
  24. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protocols. 2008, (2008).
  25. Cornell, W. C., et al. Paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis. Journal of Visualized Experiments. (133), e57196 (2018).
  26. Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. Journal of Visualized Experiments. (139), e58288 (2018).
  27. Baena, V., Schalek, R. L., Lichtman, J. W., Terasaki, M. Serial-section electron microscopy using automated tape-collecting ultramicrotome (ATUM). Methods in Cell Biology. 152, 41-67 (2019).
  28. Yamaguchi, M., Chibana, H. A method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (131), e56235 (2018).
  29. Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433 (2021).
  30. Landowski, M., et al. Modulation of Tmem135 leads to retinal pigmented epithelium pathologies in mice. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 61 (12), 16 (2020).
  31. Mori, H., et al. Developmental and age-related changes to the elastic lamina of Bruch's membrane in mice. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (2), 289-301 (2019).
  32. Chen, M., et al. Retinal pigment epithelial cell multinucleation in the aging eye - a mechanism to repair damage and maintain homoeostasis. Aging Cell. 15 (3), 436-445 (2016).
  33. Ortín-Martínez, A., et al. Number and distribution of mouse retinal cone photoreceptors: differences between an albino (Swiss) and a pigmented (C57/BL6) strain. PLoS One. 9 (7), 102392 (2014).
  34. El-Danaf, R. N., Huberman, A. D. Sub-topographic maps for regionally enhanced analysis of visual space in the mouse retina. The Journal of Comparative Neurology. 527 (1), 259-269 (2019).
  35. Ortolan, D., et al. Single-cell-resolution map of human retinal pigment epithelium helps discover subpopulations with differential disease sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (19), 2117553119 (2022).
  36. Brown, E. E., Lewin, A. S., Ash, J. D. Mitochondria: Potential targets for protection in age-related macular degeneration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 11-17 (2018).
  37. Puk, O., De Angelis, M. H., Graw, J. Longitudinal fundus and retinal studies with SD-OCT: a comparison of five mouse inbred strains. Mammalian Genome. 24 (5-6), 198-205 (2013).
  38. Knott, E. J., Sheets, K. G., Zhou, Y., Gordon, W. C., Bazan, N. G. Spatial correlation of mouse photoreceptor-RPE thickness between SD-OCT and histology. Experimental Eye Research. 92 (2), 155-160 (2011).
  39. Allen, R. S., Bales, K., Feola, A., Pardue, M. T. In vivo structural assessments of ocular disease in rodent models using optical coherence tomography. Journal of Visualized Experiments. (161), e61588 (2020).
  40. Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).

Tags

JoVE'de Bu Ay Sayı 193
Yaşa Bağlı Makula Dejenerasyonunun Fare Modellerinde Retinal Pigmentli Epitel Patolojilerini Değerlendirme ve Ölçme Protokolü
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Landowski, M., Grindel, S., Hao, Y., … More

Landowski, M., Grindel, S., Hao, Y., Ikeda, S., Bowes Rickman, C., Ikeda, A. A Protocol to Evaluate and Quantify Retinal Pigmented Epithelium Pathologies in Mouse Models of Age-Related Macular Degeneration. J. Vis. Exp. (193), e64927, doi:10.3791/64927 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter