Method Article

פרוטוקול להערכה וכימות של פתולוגיות אפיתל פיגמנטי ברשתית במודלים עכבריים של ניוון מקולרי הקשור לגיל

DOI:

10.3791/64927

⸱

March 10th, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Genetics, University of Wisconsin-Madison, 2McPherson Eye Research Institute, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Ophthalmology, Duke University, 4Department of Cell Biology, Duke University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מודלים של עכברים יכולים להיות כלים שימושיים לחקר הביולוגיה של אפיתל פיגמנטי ברשתית (RPE). נקבע כי עכברים יכולים לפתח מערך של פתולוגיות RPE. כאן, אנו מתארים פרוטוקול פנוטיפ כדי להבהיר ולכמת פתולוגיות RPE בעכברים באמצעות אור, אלקטרונים הולכה ומיקרוסקופ קונפוקלי.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניוון מקולרי תלוי גיל (AMD) הוא הפרעת רשתית מתישה באוכלוסיות מזדקנות. הסברה הרווחת היא כי תפקוד לקוי של אפיתל פיגמנטי ברשתית (RPE) הוא אירוע פתוביולוגי מרכזי ב- AMD. כדי להבין את המנגנונים שמובילים לתפקוד לקוי של RPE, חוקרים יכולים להשתמש במודלים של עכברים. מחקרים קודמים קבעו כי עכברים יכולים לפתח פתולוגיות RPE, שחלקן נצפות בעיניהם של אנשים שאובחנו עם AMD. כאן, אנו מתארים פרוטוקול פנוטיפ להערכת פתולוגיות RPE בעכברים. פרוטוקול זה כולל הכנה והערכה של חתכי רשתית באמצעות מיקרוסקופ אור ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת, כמו גם זה של תושבות שטוחות RPE במיקרוסקופ קונפוקלי. אנו מפרטים את הסוגים הנפוצים של פתולוגיות RPE מורין שנצפו על ידי טכניקות אלה ודרכים לכמת אותם באמצעות שיטות משוחדות לבדיקות סטטיסטיות. כהוכחת היתכנות, אנו משתמשים בפרוטוקול פנוטיפ RPE זה כדי לכמת את פתולוגיות RPE שנצפו בעכברים בעלי ביטוי יתר של חלבון טרנסממברנה 135 (Tmem135) ועכברי בר מזדקנים מסוג C57BL/6J. המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא להציג שיטות פנוטיפ RPE סטנדרטיות עם הערכות כמותיות בלתי משוחדות עבור מדענים המשתמשים במודלים עכבריים של AMD.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניוון מקולרי תלוי גיל (AMD) היא מחלה מסנוורת נפוצה הפוגעת באוכלוסיות מעל גיל 551. חוקרים רבים מאמינים כי תפקוד לקוי בתוך אפיתל פיגמנטי רשתית (RPE) הוא אירוע פתוביולוגי מוקדם ומכריע ב- AMD2. RPE היא שכבה אחת של תאים מקוטבים שתפקידה לשמור על ההומאוסטזיס של פוטורצפטורים שכנים וכלי דם כורואידיים3. קיימים מגוון מודלים לחקר מנגנונים הקשורים למחלות בתוך RPE, כולל מודלים של תרביות תאים 4,5 ועכברים 6,7,8. דו"ח שפורסם לאחרונה תיאר פרוטוקולים סטנדרטיים וקריט....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים המערבים נבדקים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון, והם תואמים את הצהרת האגודה לחקר הראייה והעיניים (ARVO) לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה.

1. הערכת RPE עכבר על ידי מיקרוסקופ אור

  1. הכינו חיץ קיבוע בריכוז סופי של 2% פרפורמאלדהיד ו-2% גלוטראלדהיד בטמפרטורת החדר (RT) בבקבוק זכוכית.
    הערה: פרוטוקול זה דורש, לכל היותר, 14 מ"ל של מאגר קיבוע לכל עכבר.
    אזהרה: פרפורמאלדהיד וגלוטראלדהיד הם חומרים מסוכנים. אנא עקוב אחר נהלי ההפעלה הסטנדרטיים בעת עבודה עם חומרים אלה.
  2. הכינו מערכת זילוח הניזונה מכוח הכבידה על כרית תחתונה סופגת לזילוח לב במכסה....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השלמת פרוטוקול הפנוטיפ RPE המתואר במאמר זה מספקת ניתוח כמותי של הפרעות RPE מבניות הנצפות בדרך כלל במודלים עכבריים של AMD. כדי לאשר את יעילותו של פרוטוקול זה, השתמשנו בו בעכברים הידועים כמציגים פתולוגיות RPE, כולל עכברים טרנסגניים המבטאים יתר על המידה WT Tmem135 המונע על ידי מקדם בטא-אקטין עוף (Tmem135 TG)30 ועכברי C57BL/6J מיושנים 31,32. מטרת ניסויים אלה היא להראות תוצאות מייצגות שניתן להשיג באמצעות השיטות המתוארות בפרוטו.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במאמר זה, הצגנו פרוטוקול פנוטיפ להערכת פתולוגיות RPE מבניות של מודלים עכבריים. תיארנו את השלבים הנדרשים לעיבוד העיניים עבור טכניקות הדמיה שונות, כולל אור, אלקטרונים הולכה ומיקרוסקופ קונפוקלי, כמו גם את כמות הפתולוגיות האופייניות שנצפו בשיטות הדמיה אלה. הוכחנו את היעילות של פרוטוקול פנוטיפ RPE שלנו על ידי בחינת Tmem135 TG ועכברי WT בני 24 חודשים, שכן עכברים אלה מציגים פתולוגיות RPE30,31,32. פרוטוקול זה יכול להיו.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברי פרוטוקול זה אין גילויים וניגודי אינטרסים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצים להודות לסאטושי קינושיטה ולאוניברסיטת ויסקונסין (UW) יוזמות מחקר תרגומי במעבדה לפתולוגיה (TRIP) על הכנת הרקמות שלנו למיקרוסקופ אור. ליבה זו נתמכת על ידי המחלקה לפתולוגיה ורפואת מעבדה באוניברסיטת UW, המרכז לסרטן פחמן באוניברסיטת ויסקונסין (P30 CA014520), ומשרד מנהל NIH (S10OD023526). מיקרוסקופיה קונפוקלית בוצעה בליבה האופטית של UW Biochemistry, שהוקמה בתמיכת המחלקה לביוכימיה של UW. עבודה זו נתמכה גם על ידי מענקים מהמכון הלאומי לעיניים (R01EY022086 ל A. Ikeda; R01EY031748 אל C. Bowes Rickman; P30EY016665 למחלקה לרפואת עיניים ומדעי הראייה באוניברסיטת וושינגטון; P30EY005722 למרכז דיוק איי; NIH T32EY027721 למ. לנדובסקי; F32EY032766 למ. לנדובסקי), טימותי ויליאם....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.1 M Cacodylate Buffer pH7.2PolyScientiifc R& D CompanyS1619
100 קיבולתתיבת שקופיות דרושה שתיים לפרוטוקול זה (אחת עבור H& שקופיות מוכתמות E ואחת לתושבות שטוחות RPE.)
100% אתנול מחסן MDS2292-CASEיכול לשמש לייצור תמיסות אתנול מדוללות בפרוטוקול זה.
פקק חד כיווני, 2 מנעולי לואר נקבהQosina11069
1x תמיסת חיץ פוספט (PBS)ניתן להשתמש מראש 1x PBS בפרוטוקול זה. 
2.0 מ"ל מיקרו-צינורותGenesee Scientific 24-283-LR
24 הטמעת חלל קפסולה תחליף עובשמיקרוסקופיה Sciences70165
24 אינץ 'צינורות PVC עם Luer Endsפישר NC1376778
מדעי 400 רשת גילדר דק בר רשתות רשת מרובעותמיקרוסקופיה מדעיT400-Cu
95% אתנולMDS מחסן2293-CASE
רפידות תחתונות סופגות עם מחסום לחות עמיד למים (23 אינץ' על 24 אינץ')VWR56616-031
מתכוונן 237 מ"ל  בקבוק ריסוסVWR23609-182
Alexa Fluor488 חמור מצומד נגד ארנב IgG תרמו פישר מדעיA-21206
רדיד
BD דיוק גלישה 19 מד מזרק מחטסיגמא-אולדריץ' 
מלקחיים ברקן; מעוקל; שיניים צולבות עדינות; אורך 4 אינץ', 1 מ"מ רוחב קצהמכשיר כירורגי RobozRS-5211ידוע כמלקחיים מעוקלים בפרוטוקול זה.
מברשת שיער גמלמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית65575-02
המתת חסד פחמן
דו חמצני מד
חמצני מיכל
מהדקי הארכת חוד קסטלויפישר מדעי 05-769-7Q
מעמד תמיכת בסיס בצורת L מברזל יצוקפישר סיינטיפיק 11-474-207
הגדלת תאיםזמינה להורדה: https://cellprofiler.org/releases
לק שקוףמיקרוסקופיה אלקטרונית מדעי72180
Colorfrost מיקרוסקופ שקופיות לבנדרVWR10118-956
מחשב
DAPIסיגמא-אולדריץ'D9542-5MG
מזוקקים H20ממערכת הטיהור Milli-Q.
פינצטה עם קצה דק של דומונט; דפוס #55מכשיר כירורגי רובוזRS-4984הידוע כמלקחיים עדינים בפרוטוקול זה, ו-3 דרושים לפרוטוקול זה (שניים לדיסקציה ואחד לעיבוד מיקרוסקופ אלקטרונים).
מחזיק רשת מיקרוסקופיה אלקטרוניתמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית71147-01
EPON 815 שרףאלקטרונים מיקרוסקופיה מדעית14910
Epredia Mark-It סימון רקמות צבע צהובפישר מדעי 22050460אנא עקוב אחר פרוטוקול היצרן בעת שימוש בצבע סימון רקמות זה. 
Epredia הרכבהמדיה Fisher Scientific22-110-610שימוש להרכבה H& שקופיות E. 
סדרת תאורה Fiber-Lite Mi-150, מקור אור הלוגן 150 wDolan-Jenner IndustriesMi-150מקור אור לניתוח מיקרוסקופ.
Fiji ImageJזמינה להורדה: https://imagej.net/downloads
Flexaframe Castaloy Hook ConnectorThermo Scientific   14-666-18Q
מכסה אדים
גלוטרלדהיד 2.5% במאגר פוספט, pH 7.4, 32%מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים16537-05
JEM-1400 מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (JEOL) עם שייקר
שניים דרושים לניסויים אלה. האחד צריך להיות בטמפרטורת החדר ואילו השני צריך להיות בחדר קר של 4 מעלות צלזיוס.
לייזר קריו תג תוויותמיקרוסקופיה מדעי77564-05
עופרת ציטראטאלקטרונים מיקרוסקופיה מדעי17800
Leica EM UC7Ultramicrotome
Leica Reichert Ultracut S Microtome
LifterSlipsThermo Fisher Scientific22X22I24788001LSהשתמש בכיסויים אלה עבור תושבות ה-RPE השטוחות מכיוון שיש להן קצוות מוגבהים ומתאימות לעובי ה-RPE.
המטוקסילין של מאיירVWR100504-406
McPherson-Vannas מספריים קפיציים מיקרו מנתחיםמכשיר כירורגי RobozRS-5600הידוע כמספריים מיקרו-ניתוחים בפרוטוקול. 
מתנולפישר סיינטיפיק עכברי A412-4
כל דגם עכבר של AMD והפקדים המתאימים לו יכולים לעבוד עבור פרוטוקול זה.
מספריים לניתוח מיקרו; גרסה סטנדרטית; מעוקל; נקודות חדות; אורך להב 24 מ"מ; 4.5 אינץ'מכשיר כירורגי RobozRS-5913המכונה מספריים מעוקלים בפרוטוקול זה.
מדפי
של מיקרוסופט אקסל
ניקון A1RS מיקרוסקופ
סרום חמור רגילSouthernBiotech0030-01
מספר 11 להבי אזמל חד פעמיים סטרילייםVWR21909-380
אוסמיום טטרוקסיד מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית19150
פרפורמלדהיד, 32%מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית15714-S
צלחת פטרי עיפרון
VWR 21909-380
פיפטות קצות
פיפטה 
פוליקלונלי אנטי-ZO-1 נוגדןתרמו פישר מדעי402200
פרופילן אוקסידאלקטרונים מיקרוסקופיה מדעית20412
סכין גילוחVWR10040-386
מגש רדוד לזלוף
שנדון Eosin Y אלכוהוליVWR89370-828
Sharpie Ultra Fine Tip שחור קבוע סמןמהדקים642736
מתלה שקופיות להכתמתGrainger49WF31
כיסוי מרובע זכוכית מחליקפישר סיינטיפיק 12-541B
צלחת מכתים עם כיסויGrainger49WF30צריך 15 עבור H& הליך צביעה E.
יעד מזרק Luer-Slip חד פעמי מפלסטיק 50 מ"ל תרמו סיינטיפיק S7510-50השתמש רק בקנה המזרק.
טיימרפישר1464917
אורניל אצטטאלקטרונים מיקרוסקופיה מדעי22400
תנור
Vectashield הרכבה מעבדותוקטורH-1000השתמש להרכבת תושבות שטוחות RPE. 
קסילןפישר סיינטיפיק 
Zeiss Axio Imager 2 מיקרוסקופ אור למיקרוסקופזה יש את היכולת ליצור תמונות תפורות פי 20. אם למיקרוסקופ אור אין יכולת זו, צלם תמונות של הרשתית כולה החופפות מעט זו את זו. השתמשו ב-Adobe Photoshop כדי לחבר את התמונות הללו יחד. אנא עיין במדריכים של תוכנית Adobe Photoshop לתפירת תמונות. 
Zeiss Stemi 2000 ניתוח מיקרוסקופמיקרוסקופ אלקטרונים מדעי65575-02
אלקטרונים אלקטרונים אלומיניוםZ192546תא זרימת פחמן דופחמן דו חמצניתוכנית בפרוטוקול זה נעשה שימוש במים תוכנית שולחן מעבדת מצלמות CCD ORIUS (1000) אלקטרונים באורך כולל מיקרוטיובקונפוקליעכבריםואקום בינוני 22050283

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet. Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).
  2. Bhutto, I., Lutty, G.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Retinal Pigmented EpitheliumAge Related Macular DegenerationMouse ModelsRPE PathologiesLight MicroscopyTransmission Electron MicroscopyConfocal MicroscopyCardiac PerfusionRPE QuantificationMolecular Pathways

Related Articles