Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

פרוטוקול להערכה וכימות של פתולוגיות אפיתל פיגמנטי ברשתית במודלים עכבריים של ניוון מקולרי הקשור לגיל

Published: March 10, 2023 doi: 10.3791/64927
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 1,2, 3,4, 1,2
1Department of Medical Genetics, University of Wisconsin-Madison, 2McPherson Eye Research Institute, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Ophthalmology, Duke University, 4Department of Cell Biology, Duke University

Summary

מודלים של עכברים יכולים להיות כלים שימושיים לחקר הביולוגיה של אפיתל פיגמנטי ברשתית (RPE). נקבע כי עכברים יכולים לפתח מערך של פתולוגיות RPE. כאן, אנו מתארים פרוטוקול פנוטיפ כדי להבהיר ולכמת פתולוגיות RPE בעכברים באמצעות אור, אלקטרונים הולכה ומיקרוסקופ קונפוקלי.

Abstract

ניוון מקולרי תלוי גיל (AMD) הוא הפרעת רשתית מתישה באוכלוסיות מזדקנות. הסברה הרווחת היא כי תפקוד לקוי של אפיתל פיגמנטי ברשתית (RPE) הוא אירוע פתוביולוגי מרכזי ב- AMD. כדי להבין את המנגנונים שמובילים לתפקוד לקוי של RPE, חוקרים יכולים להשתמש במודלים של עכברים. מחקרים קודמים קבעו כי עכברים יכולים לפתח פתולוגיות RPE, שחלקן נצפות בעיניהם של אנשים שאובחנו עם AMD. כאן, אנו מתארים פרוטוקול פנוטיפ להערכת פתולוגיות RPE בעכברים. פרוטוקול זה כולל הכנה והערכה של חתכי רשתית באמצעות מיקרוסקופ אור ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת, כמו גם זה של תושבות שטוחות RPE במיקרוסקופ קונפוקלי. אנו מפרטים את הסוגים הנפוצים של פתולוגיות RPE מורין שנצפו על ידי טכניקות אלה ודרכים לכמת אותם באמצעות שיטות משוחדות לבדיקות סטטיסטיות. כהוכחת היתכנות, אנו משתמשים בפרוטוקול פנוטיפ RPE זה כדי לכמת את פתולוגיות RPE שנצפו בעכברים בעלי ביטוי יתר של חלבון טרנסממברנה 135 (Tmem135) ועכברי בר מזדקנים מסוג C57BL/6J. המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא להציג שיטות פנוטיפ RPE סטנדרטיות עם הערכות כמותיות בלתי משוחדות עבור מדענים המשתמשים במודלים עכבריים של AMD.

Introduction

ניוון מקולרי תלוי גיל (AMD) היא מחלה מסנוורת נפוצה הפוגעת באוכלוסיות מעל גיל 551. חוקרים רבים מאמינים כי תפקוד לקוי בתוך אפיתל פיגמנטי רשתית (RPE) הוא אירוע פתוביולוגי מוקדם ומכריע ב- AMD2. RPE היא שכבה אחת של תאים מקוטבים שתפקידה לשמור על ההומאוסטזיס של פוטורצפטורים שכנים וכלי דם כורואידיים3. קיימים מגוון מודלים לחקר מנגנונים הקשורים למחלות בתוך RPE, כולל מודלים של תרביות תאים 4,5 ועכברים 6,7,8. דו"ח שפורסם לאחרונה תיאר פרוטוקולים סטנדרטיים וקריטריונים לבקרת איכות עבור מודלים של תרביות תאי RPE 4, אך אף דוח לא ניסה לתקנן את הפנוטיפ של RPE במודליםשל עכברים. למעשה, פרסומים רבים על מודלים עכבר של AMD חסר תיאור מלא של RPE או כימות של פתולוגיות RPE בהם. המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להציג שיטות פנוטיפ RPE סטנדרטיות עם הערכות כמותיות בלתי משוחדות עבור מדענים המשתמשים במודלים של עכברי AMD.

פרסומים קודמים ציינו את נוכחותן של מספר פתולוגיות RPE בעכברים באמצעות שלוש טכניקות הדמיה. לדוגמה, מיקרוסקופ אור מאפשר לחוקרים לצפות במורפולוגיה הגסה של רשתית המורין (איור 1A) ולזהות פתולוגיות RPE כמו דילול RPE, אידוי ונדידה. דילול RPE בדגם עכבר AMD מודגם על-ידי סטייה בגובה RPE מהפקדים המתאימים (איור 1B). ניתן לחלק את vacuolization RPE לשתי קטגוריות נפרדות: microvacuolization (איור 1C) ו-macrovacuolization (איור 1D). מיקרוווקוליזציה RPE מסוכמת על ידי נוכחות של vacuoles ב RPE שאינם משפיעים על גובהו הכולל, ואילו macrovacuolization מסומן על ידי נוכחות של vacuoles הבולטים לתוך החלקים החיצוניים של photoreceptors. נדידת RPE נבדלת על-ידי צבר מוקדי של פיגמנט מעל חד-שכבה RPE בחתך רשתית (איור 1E). יש לציין כי תאי RPE נודדים בעיניים של תורם AMD מפגינים תגובתיות חיסונית לסמנים של תאי מערכת החיסון, כגון אשכול התמיינות 68 (CD68)9, ויכולים לייצג תאים חיסוניים הבולעים פסולת RPE או RPE העוברים התמיינות 9. שיטת הדמיה נוספת שנקראת מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת יכולה לאפשר לחוקרים לדמיין את המבנה העל-קרקעי של RPE ואת קרום המרתף שלו (איור 2A). שיטה זו יכולה לזהות את מרבץ תת-RPE הדומיננטי בעכברים, הידוע בשם מרבץ למינרי בסיסי (BLamD) (איור 2B)10. לבסוף, מיקרוסקופ קונפוקלי יכול לחשוף את המבנה של תאי RPE באמצעות הדמיה של תושבות RPE שטוחות (איור 3A). שיטה זו יכולה לחשוף דיסמורפיה של RPE, סטייה של RPE מצורת חלת הדבש הקלאסית שלו (איור 3B). הוא יכול גם לזהות ריבוי גרעיני RPE, נוכחות של שלושה גרעינים או יותר בתוך תא RPE (איור 3C). לסיכום סוגי פתולוגיות RPE הקיימות בדגמי עכבר AMD הנוכחיים, אנו מפנים חוקרים לסקירות אלה מהספרות 6,7.

חוקרים החוקרים AMD צריכים להיות מודעים ליתרונות ולחסרונות של שימוש בעכברים כדי לחקור פתולוגיות RPE לפני פרוטוקול הפנוטיפ. לעכברים יש יתרון בגלל תוחלת החיים הקצרה יחסית שלהם והחסכוניות שלהם, כמו גם המניפולציה הגנטית והפרמקולוגית שלהם. עכברים מפגינים גם שינויים ניווניים ב-RPE, כולל נדידת RPE, דיסמורפיה ורב-גרעיניות, הנצפים בעיניים של תורם AMD 11,12,13,14,15,16,17; זה מצביע על כך שמנגנונים דומים עשויים לעמוד בבסיס התפתחותן של פתולוגיות RPE אלה בעכברים ובבני אדם. עם זאת, ישנם הבדלים מרכזיים המגבילים את יכולת התרגום של מחקרי עכברים ל- AMD אנושי. ראשית, לעכברים אין מקולה, אזור מובחן אנטומית של הרשתית האנושית הדרוש לחדות הראייה המושפעת באופן מועדף ב- AMD. שנית, חלק מהפתולוגיות של RPE בעכברים, כמו דילול RPE והתאדות, אינן נראות בדרך כלל בעיניים של תורם AMD18. שלישית, עכברים אינם מפתחים דרוסן, סימן היכר של פתולוגיה של AMD19. דרוזן הם מרבצים המכילים שומנים וחלבונים עם מעט מאוד חלבוני קרום מרתף הנוצרים בין הלמינה הבסיסית RPE לבין שכבת הקולגן הפנימית של קרום ברוך (BrM)19. דרוזן שונה מ-BLamD, המרבץ התת-RPE הנפוץ בעכברים, הן בהרכבם והן במיקום האנטומי שלהם. BLamDs הן הפרעות חוץ-תאיות מועשרות במטריצה חוץ-תאית תלויות גיל ומתח הנוצרות בין הלמינה הבסיסית RPE של BrM לבין הקיפולים הבסיסיים של RPE20. באופן מעניין, ל-BLamDs יש הרכב חלבון דומה ומראה דומה גם בעכברים וגם בבני אדם 6,10,21. מחקרים אחרונים מצביעים על כך ש- BLamDs עשוי לפעול בפתולוגיה של AMD על ידי השפעה על התקדמות AMD לשלביו המאוחרים 18,22; לפיכך, משקעים אלה עשויים לייצג RPE חולה ברשתית העכבר. הידע על היתרונות והמגבלות הללו הוא קריטי עבור חוקרים המעוניינים לתרגם תוצאות ממחקרי עכברים ל- AMD.

בפרוטוקול זה, אנו דנים בשיטות להכנת העיניים לאור, אלקטרונים הולכה ומיקרוסקופ קונפוקלי כדי לדמיין פתולוגיות RPE. אנו גם מתארים כיצד לכמת פתולוגיות RPE באופן בלתי משוחד לבדיקות סטטיסטיות. כהוכחת היתכנות, אנו משתמשים בפרוטוקול הפנוטיפ RPE כדי לחקור את הפתולוגיות המבניות של RPE שנצפו בחלבון טרנסממברנה 135- (Tmem135) המביע יתר על המידה עכברים ועכברים מזדקנים מסוג בר (WT) C57BL/6J. לסיכום, אנו שואפים לתאר את מתודולוגיית הפנוטיפ כדי לאפיין את RPE במודלים עכברים של AMD, שכן אין כיום פרוטוקולים סטנדרטיים זמינים. חוקרים המעוניינים לבחון ולכמת פתולוגיות של פוטורצפטורים או כורואיד, המושפעים גם במודלים של עכברי AMD, עשויים שלא למצוא פרוטוקול זה שימושי למחקריהם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים המערבים נבדקים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון, והם תואמים את הצהרת האגודה לחקר הראייה והעיניים (ARVO) לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה.

1. הערכת RPE עכבר על ידי מיקרוסקופ אור

  1. הכינו חיץ קיבוע בריכוז סופי של 2% פרפורמאלדהיד ו-2% גלוטראלדהיד בטמפרטורת החדר (RT) בבקבוק זכוכית.
    הערה: פרוטוקול זה דורש, לכל היותר, 14 מ"ל של מאגר קיבוע לכל עכבר.
    אזהרה: פרפורמאלדהיד וגלוטראלדהיד הם חומרים מסוכנים. אנא עקוב אחר נהלי ההפעלה הסטנדרטיים בעת עבודה עם חומרים אלה.
  2. הכינו מערכת זילוח הניזונה מכוח הכבידה על כרית תחתונה סופגת לזילוח לב במכסה אדים (איור משלים 1A).
    1. הכניסו 40 מ"ל של החיץ המקובע לחבית המזרק של מערכת הזילוח (איור משלים 1B).
    2. סובב את השסתום עד שהוא מקביל לקו הצינור כדי לאפשר לחיץ לזרום דרך קו הצינור (איור משלים 1C). שטפו את הקו בחיץ עד שכל בועות האוויר יוסרו מהקו.
    3. סובב את השסתום עד שהוא מאונך לקו הצינור כדי לעצור את החיץ מלזרום לתוך קו הצינור (איור משלים 1D).
      הערה: מערכת הזילוח מוכנה כעת לשימוש.
  3. הרדימו את העכבר על ידי הכנסתו לתא פחמן דו-חמצני (CO2) ואפשרו ל-CO2 לזרום לתוך התא בקצב זרימה של 30% מנפח התא לדקה. ברגע שהעכבר מפסיק לנשום, אפשרל-CO2 לזרום לתוך התא למשך דקה אחת לפחות. ודא שהעכבר מת לפני שתמשיך לשלב הבא.
    הערה: המתת חסד באמצעות הזרקה של חומרים פרמקולוגיים יכולה לשמש בפרוטוקול זה כחלופה לשאיפתCO2 .
  4. בצע זילוח לב על העכבר המתת חסד.
    1. העבירו את העכבר למגש רדוד ליד מערכת הזילוח כשהבטן שלו פונה כלפי מעלה. רססו את הבטן באתנול 70% (EtOH).
    2. בצעו ארבעה חתכים כדי לחשוף את חלל הבטן (איור משלים 2A).
      1. צור חיתוך נחות של 5 ס"מ באמצעות מספריים ומלקחיים מעוקלים דרך העור ודופן הבטן בצד השמאלי הרחוק ביותר של העכבר שנמצא ישירות מתחת לכלוב הצלעות.
      2. המשך לבצע חתך מדיאלי של 3 ס"מ דרך העור וקיר הבטן של העכבר שמתחיל בחלק העליון של החתך הנחות.
      3. בצע חתך נחות נוסף של 5 ס"מ בקצה החתך המדיאלי דרך העור ודופן הבטן בצד הימני הרחוק ביותר של העכבר ישירות מתחת לכלוב הצלעות.
      4. בצע חתך מדיאלי נוסף של 3 ס"מ להסרת דש עור הבטן עם מלקחיים מעוקלים.
    3. חתכו דרך הסרעפת ועצם החזה כדי לחשוף את הלב (איור משלים 2B).
      הערה: יש להיזהר מפגיעה בלב, בעורקים ובוורידים. טיפול באלה יוביל לזילוח לב לא יעיל.
    4. הכנס את מחט המד לחדר השמאלי של הלב. סובב את השסתום עד שהוא מקביל לקו הצינור. חתכו את האטריום הימני בעזרת מספריים מעוקלים כדי לאפשר לדם ולקיבוע לצאת מהלב (איור משלים 2C).
    5. אפשר 10 מ"ל של חיץ קיבוע לחדור את העכבר לפחות 1-2 דקות, או עד שהכבד הופך חיוור בצבע ולא זורם דם מהאטריום הימני. לאחר השלמת הזילוח, סובב את השסתום עד שהוא מאונך לקו הצינור כדי לעצור את זרימת החיץ.
  5. לחנך את העיניים מן העכבר לאחר זילוח הלב.
    1. הסר את העכבר מהמגש הרדוד והנח את העכבר על התחתונים הסופגים במכסה אדים. כיוון את ראש העכבר כך שהעין השמאלית פונה לנסיין והעין הימנית מחוץ לטווח הראייה. הוסף הערות לצד העליון של העין עם צבע סימון רקמות.
    2. דחפו בעדינות כלפי מטה עם האגודל והאצבע המורה סביב ארובת העין כדי לגרום לבליטה של העין מארובת העין (איור משלים 3A).
    3. קחו מספריים מעוקלים והחזיקו אותם עם הלהב בזווית של 30° מארובות העין. המשיכו לחתוך מסביב לעין עם המספריים המעוקלים בזווית של 30° (איור משלים 3B).
      הערה: זה בסדר לחתוך רקמה עודפת מארובת העין כדי לשמור על שלמות גלגל העין.
    4. הסר את גלגל העין מהראש בעזרת מלקחיים מעוקלים והנח אותו על כרית תחתונה סופגת. ניקב את הקרנית עם להב אזמל מספר 11 ומקם את העין עם מלקחיים מעוקלים לתוך מיקרו-צינור 2 מ"ל עם 2 מ"ל של חיץ מקבע. תייג את microtube 2 מ"ל עם זיהוי העכבר 'שמאל' כדי לציין את העין השמאלית.
      הערה: הניק בקרנית מאפשר לקיבוע לחדור בקלות לעין כדי לשמר אותה טוב יותר.
    5. חזור על שלבים 1.5.1-1.5.4 עבור עין ימין.
  6. אפשרו לעיניים לדגור בחיץ מקובע למשך הלילה על שייקר בחדר של 4°Csius (C), במהירות של 75 סיבובים לדקה (סל"ד).
  7. החלף את המאגר המקבע ב- 2 מ"ל של מלח חיץ פוספט 1x (PBS). לדגור על העיניים ב-1x PBS למשך 10 דקות על שייקר ב-RT וב-75 סל"ד. חזור על שלב זה פעמיים.
  8. נקו ונתחו את העיניים כדי ליצור מקטעים אחוריים.
    הערה: החלק האחורי הוא גלגל העין של העכבר עם הרשתית העצבית, RPE, כורויד ולובן העין ללא הקרנית, הקשתית והעדשה.
    1. הניחו את העין בתוך צלחת פטרי מלאה ב-PBS 1x תחת מיקרוסקופ מנתח (איור משלים 4A).
    2. הרימו בעדינות את כל השומן והשריר מגלגל העין בעזרת מלקחיים עדינים. חתכו בזהירות את השומן והשריר בעזרת מספריים מנתחים מיקרו בכיוון מקביל לגלגל העין עד שגלגל העין יקבל צבע כחלחל-שחור אחיד (איור משלים 4B).
      הערה: אין לחתוך בכיוון מאונך, מכיוון שהדבר פוגע בגלגל העין. כמו כן, אם צבע סימון הרקמה יורד במהלך העיבוד, הוסף הערות מיד לצד העליון של גלגל העין.
    3. הניחו מלקחיים עדינים באתר ניקור הקרנית. חתכו מסביב להיקף הקרנית, החל מאתר הניקוב, בעזרת מספריים שחתכו מיקרו, כדי להסיר את הקרנית והקשתית מגלגל העין (איור משלים 4C).
    4. קחו מלקחיים עדינים והוציאו בעדינות את העדשה מגלגל העין כדי ליצור את המקטע האחורי (איור משלים 4D).
    5. החזירו את המקטע האחורי למיקרו-צינור בנפח 2 מ"ל עם 2 מ"ל של 1x PBS. אחסנו את החלק האחורי במקרר בטמפרטורה של 4°C.
      הערה: מקטעים אחוריים יכולים להישאר ב-1x PBS ב-4°C במשך שבועות רבים לפני המשך העיבוד.
  9. חזור על שלבים 1.3-1.8 כדי להכין את העיניים מעכברים אחרים במחקר.
  10. מעבדים ומטמיעים את אחד המקטעים האחוריים מכל עכבר בפרפין לחיתוך. ודא שהצד העליון של החלק האחורי נמצא למעלה.
    הערה: המחברים מסתמכים על מעבדת Translational Research Initiatives in Pathology (TRIP) של אוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון (UW) כדי לבצע משימות אלה. להלן פרוטוקולים שפורסמו בשיטת עיבוד והטבעה דומה של פרפין23,24.
  11. חתוך וחתך כל בלוק פרפין כדי לקבל חתך רשתית בעובי 5 מיקרומטר הכולל את ראש עצב הראייה, כמו גם ארבעה קטעי רשתית נוספים בעובי 5 מיקרומטר הנמצאים במרחק של 250 מיקרומטר זה מזה. תייג את השקופיות בזיהוי עכבר ובמספר המקטע הסידורי (כלומר, 1, 2, 3, 4 או 5). אחסן את השקופיות בתיבת שקופיות.
    הערה: המחברים מסתמכים על מעבדת UW TRIP עבור שירותיהם בחתך פרפין. להלן פרוטוקולים שפורסמו בשיטת חתך פרפין דומה25,26.
  12. צבעו את השקופיות המכילות קטעי רשתית עם המטוקסילין ואאוזין (H&E). פרוטוקול של צביעת H&E ניתן למצוא באיור משלים 5.
    הערה: יש להשלים את כל השלבים של הליך צביעת H&E במכסה אדים.
  13. אסוף תמונות תפורות של קטעי רשתית מוכתמים H&E עם סרגל קנה מידה באמצעות מיקרוסקופ אור בהגדלה של פי 20.
  14. כמת את עובי RPE בתמונות הרשתית המכילות את ראש עצב הראייה עבור כל דגימה.
    1. הורד ופתח את תוכנית פיג'י ImageJ. גרור את כל תמונות הרשתית התפורים המכילות את ראש עצב הראייה לשורת המשימות של Fiji ImageJ. ודא שקנה המידה של התמונה מכויל במיקרומטר ולא בפיקסלים.
      הערה: קנה המידה של התמונה ממוקם בפינה השמאלית העליונה של החלון המכיל תמונת רשתית בתוכנית Fiji ImageJ. אם קנה המידה מוגדר בפיקסלים, עיין במדריך ההוראות של תוכנית פיג'י ImageJ כדי להמיר פיקסלים למיקרומטר.
    2. סמן כל מרווח של 300 מיקרומטר בכל תמונה מקצה ראש עצב הראייה ועד קצה הרשתית (ora serrata). לחץ על סמל Straight בשורת המשימות Fiji ImageJ. לחץ וגרור קו מקצה ראש עצב הראייה לכיוון האורה-סראטה שאורכו 300 מיקרומטר. לחץ על הכלי מברשת צבע בשורת המשימות Fiji ImageJ ולחץ על קצה קו 300 מיקרומטר כדי לסמן אותו.
    3. מדוד את עובי RPE בכל מרווח זמן מסומן. לחץ על סמל Straight בשורת המשימות Fiji ImageJ. לחץ וגרור קו מהחלק העליון לחלק התחתון של RPE (איור משלים 6). לחץ על נתח > מדידה בשורת התפריטים של Fiji ImageJ כדי לקבל את עובי RPE.
    4. העבר את מדידות עובי RPE לגיליון אלקטרוני ותייג את העמודה המכילה מדידות עם זיהוי עכבר. תייגו עמודה נוספת עם 'מרווח מסומן' והזינו את המרחק מערכי עצב הראייה (כלומר, 300, 600, 900 וכו')
      הערה: המרווח הראשון שנמדד מתאים למרחק של 300 מיקרומטר לעצב הראייה, המרווח הנמדד השני מתאים למרחק של 600 מיקרומטר, וכן הלאה.
  15. כמת שיעורי היארעות פתולוגיה RPE בהתבסס על תמונות הרשתית עבור כל דגימה.
    1. פתח את תוכנית פיג'י ImageJ.
    2. פתח את היישום Cell Counter בתוכנית Fiji ImageJ. לחץ על Plugins > Analyze > Cell Counter בשורת התפריטים של Fiji ImageJ. גרור תמונת רשתית לשורת המשימות של Fiji ImageJ ולחץ על Initialize בחלון מונה תאים .
    3. ספור את מספר הפתולוגיות RPE לכל מקטע רשתית באמצעות היישום Cell Counter . לחץ על סוג 1 תחת מונים ולאחר מכן לחץ על כל אירועי microvacuolization בתמונה. לחץ על סוג 2 תחת מונים ולאחר מכן לחץ על כל אירועי macrovacuolization בתמונה. לחץ על הקלד 3 תחת מונים ולאחר מכן לחץ על כל אירועי ההעברה הבודדים בתמונה.
    4. העבר את המספרים של פתולוגיות RPE לגיליון אלקטרוני. תייג את השורות עם microvacuolization, macrovacuolization או העברה, ואת העמודה עם זיהוי עכבר.
    5. חזור על שלבים 1.15.2-1.15.4 עבור תמונות אחרות של הדגימה. ממוצע את מספר פתולוגיות RPE לכל מדגם וחלק בחמש כדי לחשב את שיעור ההיארעות של כל פתולוגיית RPE עבור המדגם בגיליון האלקטרוני.
  16. בצע ניתוח סטטיסטי על עובי RPE בכל מרווח ושיעורי ההיארעות של פתולוגיית RPE כדי לקבוע אם יש הבדלים משמעותיים בין הקבוצות במחקר.

2. הערכת RPE עכבר על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים שידור

  1. חתכו את המקטעים האחוריים האחרים שהניבו לאחר שלבים 1.5-1.9 לשניים דרך הסימן העליון לשני חלקים עם סכין גילוח. הוסף הערות מחדש לצד העליון של המקטעים האחוריים החתוכים עם צבע סימון רקמות. הפרד את המקטעים האחוריים המחולקים למיקרו-צינורות חדשים של 2 מ"ל המכילים 2 מ"ל של PBS 1x וזיהוי עכבר.
    הערה: המקטע האחורי של העכבר גדול מדי לעיבוד בחתיכה אחת ויש לחתוך אותו לשניים לצורך עיבוד מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת.
  2. לשטוף את הרקמות עם 2 מ"ל של 0.1 M cacodylate buffer, pH 7.2. לדגור במשך 10 דקות ב RT על הספסל. חזור על שלב זה פעמיים נוספות.
  3. החלף את מאגר הקקודילט 0.1 M ב- 2 מ"ל של 2% אוסמיום טטרוקסיד (OsO4) מדולל במאגר קקודיל 0.1 M. דוגרים במשך 1.5 שעות ב-RT במכסה המנוע.
    זהירות: OsO4 הוא חומר רעיל. אנא עקוב אחר נהלי הפעלה סטנדרטיים בעת עבודה עם OsO4.
  4. שטפו את הרקמות עם 2 מ"ל של חיץ קקודילט 0.1 M במשך 10 דקות ב-RT במכסה האדים. חזור על שלב זה פעם אחת.
  5. לייבש את הרקמות עם דילול EtOH מדורג הנע בין 50% ל 100% ב RT במכסה האדים. פרוטוקול להליך ההתייבשות ניתן למצוא בתרשים משלים 7.
  6. הסר 100% EtOH מהרקמות והוסף 2 מ"ל של תחמוצת פרופילן לרקמות. יש לדגור ב-RT במכסה האדים למשך 15 דקות. הסר את תחמוצת פרופילן מן הרקמות ולהוסיף 2 מ"ל של תחמוצת פרופילן טרי לרקמות. יש לדגור ב-RT במכסה האדים למשך 15 דקות.
    אזהרה: פרופילן אוקסיד הוא חומר רעיל. אנא עקוב אחר נהלי הפעלה סטנדרטיים בעת עבודה עם תחמוצת פרופילן.
  7. הסר תחמוצת פרופילן מהרקמות והוסף 2 מ"ל של תערובת 1: 1 של תחמוצת פרופילן ושרף לרקמות. השאירו לילה תחת ואקום במכסה האדים ב-RT.
    אזהרה: שרף הוא חומר מסוכן לבני אדם. אנא עקוב אחר נהלי ההפעלה הסטנדרטיים של המעבדה בעת עבודה עם שרף.
  8. החלף את תערובת 1: 1 של תחמוצת פרופילן ושרף מרקמות עם 2 מ"ל של שרף טהור. השאירו לילה תחת ואקום במכסה האדים ב-RT.
  9. הטמע את הרקמות בשרף. מניחים תווית עם זיהוי עכבר בעיפרון וטיפת שרף לתוך התבנית. מקם את הרקמה על טיפת השרף. ממלאים את התבנית בשרף ומניחים תחת ואקום למשך שעה אחת ב-RT במכסה האדים.
  10. מקמו מחדש את התוויות והדגימות בעזרת מלקחיים בעלי קצוות עדינים, כאשר הצד האחורי של החלק האחורי של העין האחורית נמצא למעלה. השאירו את התבנית למשך הלילה על 65 מעלות צלזיוס בתנור בקולט האדים.
  11. מוציאים את התבניות מהתנור. תנו לתבניות להתקרר על הספסל. מוציאים את הבלוקים מהתבניות.
    הערה: הבלוקים מוכנים כעת לחיתוך.
  12. עצבו את קוביות השרף עם סכין גילוח ליצירת טרפז. חותכים את בלוקי השרף באמצעות מיקרוטום עד שראש עצב הראייה גלוי. המשך להשתמש בסכין יהלום כדי לחתוך חלקים דקים למחצה מגושי השרף בעובי של 0.5 מיקרומטר.
    הערה: הנה פרוטוקול שפורסם על חתך מיקרוטום27. אם תרצה, ניתן לאסוף ולהכתים חלקים חצי דקים בעובי 0.5 מיקרומטר מגושי השרף כדי להעריך את שלמות הדגימה.
  13. חתכו חתך דק במיוחד בעובי 70 ננומטר מכל בלוק גזוז באמצעות אולטרה-מיקרוטום. אסוף חתך דק במיוחד בעובי 70 ננומטר על רשת נחושת בעלת פס דק של 400 רשת. מקם את הרשת בקופסת אחסון רשת ותייג את החריץ בזיהוי עכבר.
    הערה: הנה פרוטוקול שפורסם על חתך אולטרה מיקרוטום28.
  14. צבעו את הרשתות עם 2% אורניל אצטט למשך 5 דקות ולאחר מכן עם תמיסת ציטראט עופרת 3.5% למשך 5 דקות ב-RT במכסה האדים.
    אזהרה: אורניל אצטט ועופרת ציטראט הם חומרים מסוכנים. אנא עקוב אחר נהלי הפעלה סטנדרטיים בעת עבודה עם חומרים אלה.
  15. קבל תמונות עבור כל דגימה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור בהגדלה של 15,000x, שבו קווי הרשת של רשת הנחושת מצטלבים RPE ו- BrM.
    הערה: צריכות להיות לפחות 20 עד 35 תמונות לכל מקטע ו-40 עד 70 תמונות לדגימה.
  16. כמת את גובה BLamD בתמונות עבור הדגימות במחקר.
    1. פתח את תוכנית פיג'י ImageJ. גרור את כל התמונות מהמקטע לדוגמה לשורת המשימות של Fiji ImageJ. ודאו שהתמונות מכוילות במיקרומטר ולא בפיקסלים.
    2. מדדו את גובה BLamD בתמונות. לחץ על הסמל Straight בשורת המשימות Fiji ImageJ. לחצו וגררו קו מהלמינה האלסטית של BrM לחלק העליון של המשקע הגבוה ביותר בתמונה (איור משלים 8). לחצו על 'נתח מדידה > ' בשורת התפריטים של Fiji ImageJ כדי לקבל את גובה BLamD בתמונה.
      הערה: אם אין BLamDs בתמונה, צייר קו מהלמינה האלסטית של BrM ללמינה הבסיסית של RPE.
    3. העבר את גובה BLamD לגיליון אלקטרוני ולתווית עם זיהוי עכבר.
  17. חשב את התדרים המצטברים של גבהי BLamD לכל גנוטיפ ואת הממוצעים של גובה BLamD לעכבר בגיליון האלקטרוני. בצע ניתוח סטטיסטי על ממוצעים של גובה BLamD כדי לקבוע אם יש הבדלים משמעותיים בין קבוצות במחקר.

3. הערכת RPE עכבר באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי

  1. אספו עיניים מהעכברים. הרדימו את העכברים בהתאם להליך המתואר בשלב 1.3. לחנך את העיניים באמצעות שלב 1.5. מקם את העיניים באמצעות מלקחיים מעוקלים לתוך microtube 2 מ"ל עם 2 מ"ל של 1x PBS וזיהוי עכבר.
    הערה: אין להכהות את העכברים, מכיוון שהאינטרדיגיטציה של הפוטורצפטורים והתהליכים האפיקליים של RPE מאפשרת הדמיה טובה יותר של RPE באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.
  2. נקו ונתחו את עיני העכבר באופן מיידי כדי ליצור משקפיים אחוריים של העכבר.
    הערה: העין האחורית שונה מהמקטע האחורי מכיוון שהיא אינה מכילה את הרשתית העצבית.
    1. העבירו את העין לצלוחית פטרי המכילה PBS 1x תחת מיקרוסקופ מנתח (איור משלים 9A).
    2. הסירו שומן ושריר מגלגל העין, כפי שמתואר בשלב 1.8.2 (איור משלים 9B).
    3. ניקב את הקרנית של גלגל העין עם להב אזמל מספר 11. הסר את הקרנית והקשתית, כמפורט בשלב 1.8.3 (איור משלים 9C).
    4. משוך את העדשה בעזרת מלקחיים עדינים. קח שני מלקחיים עדינים והפרד בעדינות את הרשתית העצבית מהמקטע האחורי.
    5. חתכו בזהירות את הרשתית העצבית בראש עצב הראייה לצורך הסרה מהעין האחורית (איור משלים 9D).
    6. הכנס את המשקפיים האחוריים לתוך מיקרו-צינורית חדשה של 2 מ"ל המכילה 500 μL של 1x PBS עם זיהוי עכבר.
  3. תקנו את המשקפיים האחוריים עם מתנול (MeOH) (איור משלים 10).
    הערה: שלב 3.3 נמשך כשעתיים ו-40 דקות.
    1. הוסף 500 μL של MeOH לרקמות. יש לדגור על שייקר ב-75 סל"ד למשך 5 דקות ב-RT.
    2. הסר את 500 μL של תמיסה מן הרקמות ולהוסיף 500 μL של MeOH. יש לדגור במשך 5 דקות על שייקר במהירות 75 סל"ד למשך 5 דקות ב-RT. חזור על שלב זה פעם נוספת.
    3. הסר את התמיסה כולה מהרקמות והוסף 500 μL של MeOH. יש לדגור על שייקר ב-75 סל"ד למשך שעתיים לפחות ב-RT.
      הערה: כחלופה לשלב 3.3.3, ניתן לדגור את המשקפיים האחוריים למשך הלילה ב- MeOH על שייקר ב- 75 סל"ד בחדר של 4 מעלות צלזיוס.
    4. הוסף 500 μL של 1x PBS לרקמות. יש לדגור על שייקר ב-75 סל"ד למשך 5 דקות ב-RT.
    5. הסר את 500 μL של פתרון מן הרקמות ולהוסיף 500 μL של 1x PBS. יש לדגור על שייקר ב-75 סל"ד למשך 5 דקות ב-RT. חזור על שלב זה פעם נוספת.
    6. הסר את הפתרון כולו מהרקמות והחלף אותו עם 500 μL של 1x PBS.
      הערה: הרקמות מקובעות במלואן על ידי MeOH וניתן לשמור אותן במקרר בטמפרטורה של 4°C למשך חודש אחד לפחות.
  4. בצעו צביעה אימונופלואורסצנטית של המשקפיים האחוריים כדי להמחיש צמתים הדוקים וגרעינים של RPE (איור משלים 11).
    1. הסר את 500 μL של 1x PBS מהדגימות והוסף 100 μL של סרום חמור מדולל 10% רגיל בתמיסת PBS 1x. יש לדגור על שייקר ב-75 סל"ד למשך 30 דקות ב-RT.
    2. הסר את תמיסת סרום החמור המדוללת 10% נורמלית מהדגימות והוסף 100 μL של דילול 1:50 של נוגדן רב-שבטי נגד Zonula Occludens-1 (ZO-1) ב- 1x PBS. מעבירים את הדגימות לחדר בטמפרטורה של 4°C ודגורים למשך הלילה על שייקר ב-75 סל"ד.
    3. הסר את דילול הנוגדנים מהדגימות והוסף 2 מ"ל של 1x PBS. יש לדגור על שייקר במהירות 75 סל"ד למשך 10 דקות ב-RT. חזור על שלב זה פעמיים נוספות.
    4. הסר את PBS 1x מהדגימות. הוסף 100 μL של דילול 1:250 של נוגדן IgG נגד חמור עם תג מצומד פלואורופור 488 ודילול 1:250 של 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride (DAPI) ב 1x PBS לדגימות. מכסים את הדגימות ברדיד אלומיניום ודגרים על שייקר ב-75 סל"ד למשך שעתיים ב-RT.
      הערה: הדגימות חייבות להיות מכוסות לחלוטין ברדיד אלומיניום כדי למנוע הלבנה.
    5. הסר את דילולי הנוגדנים וה- DAPI מהדגימות. הוסף 2 מ"ל של PBS 1x לדגימות, כסה מחדש ברדיד אלומיניום ודגר על שייקר במהירות 75 סל"ד למשך 10 דקות ב- RT. חזור על שלב זה שלוש פעמים נוספות.
      הערה: הצמתים ההדוקים והגרעינים של RPE מסומנים ומוכתמים כעת במלואם, בהתאמה.
  5. הרכיבו את המשקפיים האחוריים על שקופיות מיקרוסקופ.
    1. תייג שקופית מיקרוסקופ עם זיהוי עכבר. העבירו את העין האחורית למגלשת מיקרוסקופ תחת מיקרוסקופ מנתח כאשר הצד הכורואידי פונה כלפי מטה. הוסיפו טיפה של PBS 1x לעין האחורית כדי למנוע ממנה להתייבש (איור משלים 12).
    2. חתכו את העין האחורית באמצעות להב אזמל מספר 11 בארבע נקודות שיניבו ארבעה רבעים המתאימים לכיוונים הקרדינליים (כלומר, צפון, מזרח, דרום ומערב). יש לטפוח עודפי 1x PBS עם רקמה מהיקף העין האחורית. שטחו בעדינות את העין האחורית בעזרת מברשת שיער גמל ומלקחיים עדינים (איור משלים 12).
      הערה: המוצר המתקבל נקרא כעת הרכבה שטוחה RPE.
    3. הוסף טיפה של אמצעי הרכבה לתושבת השטוחה RPE והנח עליה כיסוי. יש למרוח לק שקוף כדי לאטום את הכיסוי ולאפשר לו להתייבש למשך 30 דקות לפחות במגירה סגורה. הניחו את המגלשות בקופסת מנשא שקופיות ושמרו את הקופסה במקרר בטמפרטורה של 4°C.
      הערה: היזהר להימנע מהחדרת בועות בהרכבה השטוחה RPE. ניתן לצלם תושבות שטוחות RPE במסגרת זמן של שבועיים.
  6. קבל תמונה של כל אחד מארבעת הרבעים המקיפים את עצב הראייה של ההרכבה השטוחה RPE במיקרוסקופ קונפוקלי בהגדלה של פי 20 עבור כל דגימה. דוגמה לתמונת הרכבה שטוחה RPE ניתן למצוא באיור משלים 13A.
    הערה: ייתכן שיהיה צורך לבצע הדמיה z-stack של תושבות שטוחות RPE שבו תמונות מרובות מצולמות ומוערמות כדי לפצות על הבדלים ממדיים של ההרכבה השטוחה RPE.
  7. עקוב אחר הצמתים הצפופים של תאי RPE בתוך כל תמונת הרכבה שטוחה של RPE. דוגמה לתמונת RPE בהרכבה שטוחה שניתן לעקוב אחריה ניתן למצוא באיור משלים 13B.
    1. פתח את תוכנית פיג'י ImageJ. גרור תמונת RPE להרכבה שטוחה לשורת המשימות של Fiji ImageJ. ודא שהתמונה מכויילת במיקרומטרים ולא בפיקסלים.
    2. לחצו פעמיים על סמל הכלי כיסוי מברשת בשורת המשימות Fiji ImageJ כדי להגדיר את רוחב המברשת ל- 3, את השקיפות ל- 0 ואת הצבע לאדום. לחצו על הלחצן ' סגור' בחלון הכלי מברשת כיסוי .
    3. לחצו על סמל הכלי מברשת כיסוי . לחץ וגרור על הצמתים הצפופים של כל תאי RPE שנמצאים לחלוטין בתוך התמונה.
      הערה: במקרה של טעות עקיבה, לחצו פעמיים על הסמל 'הכלי מברשת כיסוי' ולחצו על התיבה 'בטל' בחלון 'הכלי מברשת כיסוי' כדי להסיר את שגיאת העקיבה מהתמונה.
    4. לחץ על סמל המלבן בשורת המשימות Fiji ImageJ. לחץ על התמונה וגרור מסביב להיקף התמונה. לחצו על Edit > Clear בשורת התפריטים של Fiji ImageJ כדי לשמור על הקווים במעקב ולהסיר צבעים כחולים וירוקים מהתמונה.
    5. שמור את תמונת המעקב במיקום מתאים עם זיהוי עכבר, מיקום רביע (כלומר, צפון, דרום, מזרח או מערב) ותווית סיומת CP.
      הערה: אל תשמור את תמונת המעקב אחר RPE לפני השלמת שלב 3.7.4.
  8. חשב את אזורי תאי RPE עבור כל דגימה.
    1. הקצה מיקום לשמירת הקבצים מניתוח אזור RPE על-ידי יצירת תיקיה במסך שולחן העבודה של המחשב. צור תיקיות משנה עבור כל תמונת מעקב RPE ותייג את תיקיות המשנה עם זיהוי עכבר וכן עם מיקום רביע (כלומר, צפון, דרום, מזרח או מערב).
    2. התקן ופתח את התוכנית Cell Profiler29. הורד את קובץ הפרויקט Ikeda_RPE Area Calculator.cpproj (קובץ קידוד משלים 1). פתח את הקובץ Ikeda_RPE Area Calculator.cpproj על-ידי לחיצה על קובץ > פתח פרוייקט בשורת התפריטים של התוכנית Cell Profiler.
    3. גרור תמונת מעקב RPE אחת לתיבה Image > Drop Files and Folders Here בחלון התוכנית Cell Profiler.
    4. הזן את מיקום התיקיה לתוכנית Cell Profiler המתאימה לתמונת המעקב של RPE. לחץ על הגדרות פלט כפתור בפינה השמאלית התחתונה של חלון התוכנית Cell Profiler והזן את מיקום התיקיה בתיבות הטקסט תיקיית קלט ברירת מחדל ותיקיית פלט ברירת מחדל .
    5. לחץ על כפתור ניתוח תמונות בפינה השמאלית התחתונה של חלון התוכנית Cell Profiler. לאחר השלמת הניתוח, יופיע חלון ניתוח הושלם על המסך. לחץ על OK כפתור בחלון Analysis Complete .
      הערה: פעולה זו תיצור קובץ csv ותמונת jpeg. קובץ ה- csv יכיל את האזורים עבור תאי RPE בתוך תמונת המעקב. תמונת ה-jpeg תתאים לתמונת המעקב של RPE, כאשר כל תא RPE יסומן במספר (איור משלים 13C).
    6. העבר את אזורי RPE מקובץ ה- csv לגיליון אלקטרוני. תייג את הגיליון האלקטרוני עם זיהוי עכבר.
    7. בצע סקר בקרת איכות של הנתונים על ידי אישור שכל אזור RPE בקובץ ה- csv מקשר לתא RPE במעקב מלא בתמונת jpeg. הסר ערכים מהגיליון האלקטרוני שאינם תואמים לתאי RPE במעקב מלא.
    8. חזור לתוכנית Cell Profiler. לחץ לחיצה ימנית על שם תמונת המעקב של RPE בתיבה שחרר קבצים ותיקיות כאן ובחר נקה את הרשימה כדי להסיר את התמונה מהתוכנית Cell Profiler.
    9. חזור על שלבים 3.8.3-3.8.8 כדי לחשב את גדלי RPE עבור שלוש תמונות מעקב RPE הנותרות של הדגימה.
  9. כמת את ממוצעי גודל תאי RPE עבור כל מדגם בגיליון האלקטרוני.
  10. כמת את צפיפות תאי RPE עבור כל דגימה בגיליון האלקטרוני. כדי לחשב את צפיפות תאי RPE, חלק את המספר הכולל של תאי RPE לרביע בשטח הכולל של תאי RPE לרביע שזוהה על-ידי תוכנית Cell Profiler. קבע את הממוצע של צפיפות תאי RPE מארבעת הרבעים לדגימה.
  11. כמת את מספר תאי RPE מרובי גרעינים לכל הרכבה שטוחה RPE עבור כל דגימה. השתמש ביישום מונה תאים בתוכנית Fiji ImageJ, כמתואר בשלבים 1.15.1-1.15.3, כדי לספור את מספר תאי RPE עם יותר משלושה גרעינים בארבעה רבעים של הדגימה.
  12. בצע ניתוח סטטיסטי על גודל תא RPE וממוצעי צפיפותו, כמו גם על מספר תאי RPE מרובי גרעינים כדי לקבוע אם יש הבדלים משמעותיים בין קבוצות במחקר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

השלמת פרוטוקול הפנוטיפ RPE המתואר במאמר זה מספקת ניתוח כמותי של הפרעות RPE מבניות הנצפות בדרך כלל במודלים עכבריים של AMD. כדי לאשר את יעילותו של פרוטוקול זה, השתמשנו בו בעכברים הידועים כמציגים פתולוגיות RPE, כולל עכברים טרנסגניים המבטאים יתר על המידה WT Tmem135 המונע על ידי מקדם בטא-אקטין עוף (Tmem135 TG)30 ועכברי C57BL/6J מיושנים 31,32. מטרת ניסויים אלה היא להראות תוצאות מייצגות שניתן להשיג באמצעות השיטות המתוארות בפרוטוקול זה לחוקרים חדשים במודלים של עכברים.

דבקנו בשיטות בשלב 1 של הפרוטוקול לעיבוד והערכה של עיניים מעכברי WT ו - Tmem135 TG כדי להעריך פתולוגיות RPE באמצעות מיקרוסקופ אור. מצאנו שלעכברי Tmem135 TG בני 4 חודשים יש ירידה משמעותית בעובי RPE בשני מרווחי זמן מדודים ביחס ל-WT תואם גיל באמצעות ANOVA עם מבחן Tukey פוסט-הוק (איור 4). תוצאות אלה מצביעות על כך שה-RPE דק יותר בעכברי Tmem135 TG בני 4 חודשים מאשר בעכברי WT תואמי גיל במרחק של 600 ו-900 מיקרומטר מעצבים הראייה.

נוסף על כך, תוך שימוש בשיטות של שלב 1 של הפרוטוקול, חישבנו את ההיארעות של פתולוגיות RPE, כולל מיקרו-ווקוליזציה, מקרו-ווקוליזציה ונדידה של שלושה עכברי WT ו-Tmem135 TG בני 25 יום (איור 5A). התדירות הממוצעת של פתולוגיות מיקרו-ווקוליזציה של RPE לשקופית בעכברי WT הייתה 0.67 ±-0.31 ובעכברי Tmem135 TG הייתה 7.07 ±-0.61 (איור 5B). לא היה RPE macrovacuolization בעכברי WT, אבל היו, בממוצע, 5.33 ± 2.02 אירועי macrovacuolization בעכברי Tmem135 TG (איור 5C). לבסוף, שיעורי תאי RPE נודדים בכל שקופית היו אפס בעכברי WT ו-0.4 ±-0.35 בעכברי Tmem135 TG (איור 5D). לאחר ביצוע מבחן t של תלמיד, השכיחות של מיקרוווקוליזציה RPE ומיקרוווקוליזציה הייתה שונה באופן משמעותי בין עכברי WT ו - Tmem135 TG. עם זאת, השכיחות הגבוהה יותר של תאים נודדים RPE בעכברי Tmem135 TG לא הייתה שונה באופן משמעותי בהשוואה ל-WT (p = 0.1161). נתונים אלה מראים כי מיקרו-ווקוליזציה של RPE ומקרו-ווקוליזציה, אך לא הגירה, גבוהה משמעותית בעכברי Tmem135 TG בני 25 יום מאשר בעכברי WT.

בהתאם לשיטות הפרוטוקול הכלולות בשלב 2, הכנו מקטעי רשתית מעכברי WT C57BL/6J בני חודשיים ו-24 חודשים למיקרוסקופ אלקטרונים להעברה כדי לנתח את הנוכחות והגבהים של BLamDs. מצאנו BLamDs נוכחים ברשתיות WT בנות 24 חודשים שנעדרו באופן בולט ברשתיות WT בנות חודשיים (איור 6A). הצגנו את הגבהים של BLamDs ברשתית WT בת 24 חודשים על ידי חישוב והתוויית התדרים המצטברים של הופעתם. התדירויות המצטברות של גבהי BLamD צוירו כנגד גובה המרבץ כדי להמחיש את התפלגות גבהי הפיקדון. ישנה תזוזה מימין לקו עבור גבהי WT BLamD בני 24 חודשים בהשוואה לגבהים של WT BLamD בני חודשיים, מה שמדגים עלייה במרבצים בעכברי WT בני 24 חודשים (איור 6B). גרף זה נתמך על-ידי ממוצע גדול יותר של גובה BLamD ברשתיות WT בנות 24 חודשים (1.01 מיקרומטר ± 0.43 מיקרומטר) מאשר רשתיות WT בנות חודשיים (0.23 מיקרומטר ± 0.017 מיקרומטר), שהיו שונות באופן משמעותי במבחן t של תלמיד (איור 6C). לסיכום, אנו מסיקים כי לעכברי WT בני 24 חודשים יש BLamDs גדולים בחלל תת-RPE של הרשתית שלהם בהשוואה לעכברי WT בני חודשיים.

בשלב 3 יישמנו את שיטות הכנת העיניים מעכברי WT ו-Tmem135 TG בני 4 חודשים כדי ליצור תושבות RPE שטוחות לזיהוי וניתוח של דיסמורפיה RPE ורב-גרעיניות. בפרוטוקול זה, הגדרנו דיסמורפיה RPE על ידי שינויים בגודל ובצפיפות תאי RPE במודל עכבר AMD ביחס לבקרות שלהם. מצאנו שה-RPE בעכברי Tmem135 TG בני 4 חודשים הם דיסמורפיים (איור 7A). ה-RPE ברשתיות Tmem135 TG גדול יותר (806.89 מיקרומטר 2 ± 252.67 לעומת 291.69 מיקרומטר 2 ± 26.31) ופחות צפוף (0.0014 תאים/מיקרומטר 2 ± 0.00039 לעומת 0.0033 תאים/מיקרומטר 2 ± 0.00024) מאשר רשתיות WT תואמות גיל (איור 7B,C). יתר על כן, היו יותר תאי RPE מרובי גרעינים ברשתית Tmem135 TG בהשוואה לבקרות WT (8.04 תאים ± 5.54 לעומת 0.33 תאים ± 0.29) (איור 7D). כל הפרמטרים הללו הגיעו למובהקות סטטיסטית במבחן t של תלמיד. יחד, לעכברי Tmem135 TG בני 4 חודשים יש יותר תאי RPE דיסמורפיים ורב-גרעיניים מאשר לעכברי WT בני 4 חודשים.

Figure 1
איור 1: פתולוגיות RPE שזוהו במיקרוסקופ אור. תמונות מייצגות של RPE רגיל ב-WT (A) ו-RPE חריג בעכברי Tmem135 TG (B-E). פתולוגיות RPE שנצפו בעכברי Tmem135 TG כוללות דילול RPE (B), macrovacuolization (C), microvacuolization (D) והגירה (E). כל פתולוגיה מודגמת על ידי חץ שחור. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. הגדלה = 20x. קיצורים: RGC = שכבת תאי גנגליון ברשתית, IPL = שכבת פרספקס פנימית, INL = שכבה גרעינית פנימית, OPL = שכבת פרספקס חיצונית, ONL = שכבה גרעינית חיצונית, IS = מקטעים פנימיים של קולטני אור, OS = מקטעים חיצוניים של קולטני אור, RPE = אפיתל פיגמנטי ברשתית, Cho = כורואיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: פתולוגיות RPE שזוהו על-ידי מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. תמונות מייצגות של (A) RPE בעכברי CFH-H/H צעירים ו-(B) בני שנתיים CFH-H/H שיש להם משקעים למינריים בזאליים בשפע (BLamDs). BLamDs מסומנים בנקודות צהובות בתמונה. סרגל קנה מידה = 800 ננומטר. הגדלה = פי 15,000. קיצורים: N = גרעין, M = מיטוכונדריה, P = גרגיר פיגמנט, BI = קיפולי בסיס, EL = למינה אלסטית, RPE = אפיתל פיגמנטי ברשתית, BrM = הממברנה של ברוך, Cho = כורואיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: פתולוגיות RPE שזוהו על-ידי מיקרוסקופ קונפוקלי. תמונות מייצגות של (A) RPE רגיל של WT בן 8 חודשים ו-(B) RPE חריג של עכברי Tmem135 TG בני 8 חודשים המציגים דיסמורפיה של RPE. הריבוע הלבן מוגדל (C) כדי לתאר תא RPE מרובה גרעינים עם שלושה גרעינים. הצבע הירוק הוא צמתים הדוקים הקשורים ל-RPE הקשורים ל-ZO1, והצבע הכחול הוא צביעת DAPI של גרעיני RPE. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. הגדלה = 20x. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: עובי RPE בעכברי בר בני 4 חודשים (WT) ו-Tmem135 TG. (A) תמונות מייצגות של הרשתית מעכברי WT ו-Tmem135 TG (TG) בני 4 חודשים. הגדלה = פי 20. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (B) גרפים קוויים של מדידות עובי RPE בעכברי WT בני 4 חודשים (שחור) ו- Tmem135 TG (ירוק) במרחק של עד 3,000 מיקרומטר לעצב הראייה. מספרים לאחר הגנוטיפ מציינים את מספר העכברים ששימשו במחקר זה. *p < 0.05, ANOVA עם מבחן Tukey פוסט-הוק. כל הנתונים הם ממוצע ± sd. עיין במקרא איור 1 לקבלת קיצורים של שכבות רשתית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: פתולוגיות RPE בעכברי Tmem135 TG בני 25 יום. (A) תמונות מייצגות של מיקרו-ווקוליזציה של RPE, מקרו-ווקוליזציה ונדידה בשלושה עכברי Tmem135 TG (TG) בני 25 יום. פתולוגיות RPE מודגשות על ידי חצים שחורים בכל תמונה. הגדלה = פי 40. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. (B-D) כימות של מיקרו ומקרווקוליזציה של RPE וכן תאי RPE נודדים בעכברי WT ו-Tmem135 TG בני 25 יום. מספרים בסוגריים מציינים את מספר העכברים ששימשו במחקר זה. *p < 0.05 ו- ****p < 0.0001, מבחן T לתלמיד. כל הנתונים הם mean ± sd. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6: ניתוח אולטרה-סטרוקטורלי של BLamDs ברשתיות WT צעירות ומבוגרות . (A) מיקרוגרפים אלקטרונים מייצגים של WT RPE בן חודשיים ו-24 חודשים. הגדלה = פי 15,000. סרגל קנה מידה = 800 ננומטר. דוגמה להפקדה למינרית בסיסית (BLamD) מסומנת בתרשים עם סוגריים מרובעים. (B) תדרים מצטברים של גבהי BLamD. (C) ממוצעי גובה BLamD. מספרים בסוגריים מציינים את המספר הכולל של עכברים לכל גנוטיפ שנעשה בו שימוש במחקר זה. **P < 0.01, מבחן T לתלמיד. כל הנתונים הם ממוצע ± sd. אנא עיינו במקרא איור 2 לקבלת קיצורים של שכבות רשתית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: תושבות RPE שטוחות חושפות פתולוגיות RPE בעכברי Tmem135 TG. (A) תמונות מייצגות של תושבות שטוחות WT ו-Tmem135 TG (TG) RPE בנות 4 חודשים עם anti-ZO-1 בירוק ו-DAPI בכחול. הגדלה = פי 20. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (B) גודל תא RPE, (C) צפיפות תאי RPE ו-(D) ריבוי גרעיני RPE בעכברי WT ו-Tmem135 TG בני 4 חודשים. המספר בסוגריים מציין את מספר העכברים ששימשו במחקר. *p < 0.05, **p < 0.01 ו- ****p < 0.0001, מבחן T לתלמיד. כל הנתונים הם ממוצע ± sd. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור משלים 1: סכמטיות של הגדרה ושימוש בזילוח לבבי. (A) מערכת זילוח של הזנת כוח הכבידה. (B) חבית מזרק של מערכת הזילוח לחיץ קיבוע. (ג) יש לסובב את השסתום עד שיהיה מקביל לקו הצינור כדי לאפשר לחיץ לזרום דרך קו הצינור. (D) יש לסובב את השסתום עד שהוא מאונך לקו הצינור כדי לעצור את החיץ מלזרום לתוך קו הצינור. התמונה נוצרה ב- Biorender. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 2: סכמטיות של הליך זילוח לב של עכבר. (A) ארבעה חתכים שנעשו כדי לחשוף את חלל הבטן. (B) חתך שנעשה דרך הסרעפת ועצם החזה כדי לחשוף את הלב. (C) מחט מד המוחדרת לחדר השמאלי של הלב. מסובבים את השסתום עד שהוא מקביל לקו הצינור. האטריום הימני נחתך במספריים מעוקלים כדי לאפשר יציאת דם וקיבוע. התמונה נוצרה ב- Biorender. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 3: סכמטיות של הליך להוצאת עיניים מעכבר. (A) דחפו בעדינות כלפי מטה עם האגודל והאצבע המורה סביב ארובת העין כדי לגרום לבליטה של העין מארובות העין. (B) קחו מספריים מעוקלים והחזיקו אותם עם הלהב בזווית של 30° מארובות העין. המשיכו לחתוך מסביב לעין עם המספריים המעוקלים בזווית של 30°. נקודות צבעוניות מייצגות מיקום אצבע על העכבר או מספריים מעוקלים. התמונה נוצרה ב- Biorender. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 4: תמונות של דיסקציה של עין עכבר כדי להניב מקטע אחורי של עכבר. (A) עין המועברת למיקרוסקופ מנתח. (B) שומן ושריר שהוסרו מגלגל העין. (C) קרנית וקשתית שהוסרו מגלגל העין. (D) עדשה שהוסרה מגלגל העין. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 5: הליך צביעת Hematoxylin eosin (H&E). סכמטי המתאר את הליך H&E להכתמת קטעי רשתית משובצים פרפין. חצים מציינים העברה בין שלבים. הזמן של כל צעד נתון בגופן אדום. ריאגנטים לצביעה מסופקים בגופן שחור בתוך מיכלי צביעת זכוכית. צריך להיות מיכל ויטראז זכוכית מוכן עבור כל מגיב הכלול בתרשים לעיל. יש להשלים את כל השלבים במכסה אדים. בעת הוספת תלוש כיסוי לשקופית, היזהר שלא להכניס בועות לשקופית. לאחר השלמת ההליך, ניתן לאחסן שקופיות בתיבת שקופיות. התמונה נוצרה ב- Biorender. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 6: דוגמה למדידת עובי RPE. החץ השחור מתאר קו אדום מלמעלה למטה של RPE. קו זה ניתן למדוד כדי לקבוע את עובי RPE. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. הגדלה = 20x. אזור הקופסה מוקטן לצפייה קלה יותר ב- RPE. עיין במקרא איור 1 לקבלת קיצורים של שכבות רשתית. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 7: הליך התייבשות EtOH של מקטעים אחוריים של עכבר לצורך עיבוד TEM. התמונה נוצרה ב- Biorender. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

תרשים משלים 8: דוגמה למדידת גובה BLamD. הקו האדום מתאר את BLamD הגדול ביותר בתמונה זו. נקודות צהובות מסמנות BLamDs בתמונה. ניתן למדוד קו אדום זה כדי לקבוע את גובהו של BLamD זה בתמונה זו. סרגל קנה מידה = 800 ננומטר. הגדלה = פי 15,000. אנא עיינו במקרא איור 2 לקבלת קיצורים של שכבות רשתית. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 9: דיסקציה של עין העכבר להרכבה שטוחה RPE. (A) עין מועברת לצלוחית פטרי המכילה 1x PBS תחת מיקרוסקופ מנתח. (B) שומן ושריר שהוסרו מגלגל העין. (C) קרנית וקשתית שהוסרו מגלגל העין. (D) עדשה ורשתית שהוסרו מגלגל העין. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 10: הליך קיבוע מתנול (MeOH) של משקפיים אחוריים של עכבר. התמונה נוצרה ב- Biorender. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 11: הליך אימונופלואורסנציה לסימון צמתים וגרעינים הדוקים של תאי RPE. דיאגרמה המתארת שלבים של טכניקת אימונופלואורסנציה מפרוטוקול זה. הערה השלמת טכניקה זו נמשכת יומיים. כל השלבים מתרחשים ב- RT ובשייקר במהירות של 75 סל"ד, אלא אם צוין במפורש בדיאגרמה. הנוגדן העיקרי (1°) ששימש במחקר זה היה ארנב רב-שבטי anti-ZO1, והנוגדן המשני (2º) ששימש במחקר זה היה 488 חמור מצומד פלואורופור נגד ארנב IgG. לאחר הוספת הנוגדן המשני וה- DAPI לדגימות, יש לעטוף את הדגימות ברדיד אלומיניום כדי להגן מפני הלבנה של הדגימה. התמונה נוצרה ב- Biorender. קיצורים: NDS = נסיוב חמור רגיל, Ab = נוגדן. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 12: תיאור חתכים כדי להניב ארבעה רבעים של הרכבה שטוחה RPE של עכבר. N = צפון, E = מזרח, S = דרום, W = מערב. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 13: דוגמאות לנקודות קצה של ניתוח הרכבה שטוחה RPE. (A) תמונת RPE להרכבה שטוחה. (B) תמונת מעקב אחר גבול RPE. (C) RPE Cell Profiler ניתח תמונה. הגדלה = פי 20. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

קובץ קידוד משלים 1: Ikeda RPE Area Calculator.cpproj אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במאמר זה, הצגנו פרוטוקול פנוטיפ להערכת פתולוגיות RPE מבניות של מודלים עכבריים. תיארנו את השלבים הנדרשים לעיבוד העיניים עבור טכניקות הדמיה שונות, כולל אור, אלקטרונים הולכה ומיקרוסקופ קונפוקלי, כמו גם את כמות הפתולוגיות האופייניות שנצפו בשיטות הדמיה אלה. הוכחנו את היעילות של פרוטוקול פנוטיפ RPE שלנו על ידי בחינת Tmem135 TG ועכברי WT בני 24 חודשים, שכן עכברים אלה מציגים פתולוגיות RPE30,31,32. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על כל עכבר מהונדס גנטית או מטופל פרמקולוגית שעלול להכיל פתולוגיות RPE כגון דילול RPE, vacuolization, הגירה ודיסמורפיה, כמו גם BLamDs 6,7. למרות שהפתולוגיות RPE שנצפו בעכברי Tmem135 TG ועכברי WT בני 24 חודשים קיימות בדגמי עכבר AMD אחרים 7,30, חשוב לחוקר להכיר את מודל עכבר AMD שנבחר למחקריהם, שכן גיל הופעת וחומרת פתולוגיות RPE של דגם עכבר AMD שלהם עשוי להיות שונה מ- Tmem135 TG ועכברי WT בני 24 חודשים. ייתכן שהחוקרים יצטרכו להשתמש ביותר עכברים למחקריהם מאשר מספר העכברים המשמשים להפקת התוצאות המייצגות המוצגות במאמר זה, אם הצגת פתולוגיות RPE משתנה במודל העכבר AMD המתאים להם. יתר על כן, מודלים רבים של עכברי AMD זמינים כיום לחוקרי AMD, אך אין להם תיאורים מלאים של פתולוגיות RPE שלהם, מה שעשוי לדרוש מהחוקרים לבצע מחקרים ראשוניים כדי להשיג מידע זה.

למרות שניתן לבצע שינויים באופן עיבוד עיני העכבר עבור שיטות ההדמיה השונות, חיוני לשמור על הערכה כמותית של הפרעות RPE מבניות כמתואר בפרוטוקול. לדוגמה, חמישה קטעי רשתית מוכתמים H&E הוכנו כדי לספור את מספר אירועי microvacuolization RPE, macrovacuolization, ו הגירה, המאפשר לחוקרים להעריך פתולוגיות RPE במספר מיקומים ברשתית העכבר. דוגמה נוספת היא שימוש ברשת מיקרוסקופ אלקטרונים נחושת דק של 400 רשת כדי להעריך את החריגות האולטרה-מבניות של RPE. רשת מיקרוסקופ האלקטרונים מספקת מסגרת להערכת דגימת רשתית באופן שיטתי ובלתי מוטה על ידי מיקרוגרפיית אלקטרונים תמסורת, כמו גם קבלת 40 עד 70 תמונות לכל חתך רשתית כדי לבחון את נוכחותם של BLamDs. לא ניתן להשיג זאת באמצעות רשת חריץ מיקרוסקופיית אלקטרונים, ואנו מציעים לא להשתמש בהם עם פרוטוקול זה. לבסוף, לכידת תמונות הגדלה של פי 20 מארבעת הרבעים של תושבת RPE שטוחה מאפשרת לחוקרים לחקור אזורים גדולים של RPE מורין עבור דיסמורפיה ורב-גרעינים. החוקרים חופשיים להרחיב על פרוטוקול זה ולבחון קטעי רשתית נוספים עבור פתולוגיות RPE במחקריהם. יחד, שיטות אלה מאפשרות לחוקרים לאסוף נתונים רבים כדי להסיק מסקנות לגבי פתולוגיות RPE מבניות שעשויות להיות קיימות בדגמי העכבר AMD שלהם.

תכונה מרכזית נוספת של פרוטוקול זה היא עקביות של שיטות פנוטיפ RPE. לדוגמה, כל העיניים המשמשות למיקרוסקופ אלקטרונים של אור ושידור היו מכוונות על ידי הצד העליון של רשתית העכבר לצורך חיתוך. חשוב לשמור על כיוון עין העכבר לאורך כל עיבודה למיקרוסקופ אלקטרונים של אור והולכה מכיוון שלעין העכבר יש התפלגות טופוגרפית של תאי רשתית33,34. הכיוון האנטומי של עין העכבר לא נשמר להכנת RPE להרכבה שטוחה, מכיוון שלא נצפו שינויים טופוגרפיים עדיפים על נחותים של תא RPE של העכבר. למעשה, RPE ברשתית האנושית מציג שינויים טופוגרפיים המקרינים הרחק מראש עצב הראייה35, דבר המצביע על כך שזה עשוי להיות המקרה עבור RPE עכבר. לבסוף, רכישת התמונה המתוארת בפרוטוקול זה מסתמכת על המיקום האנטומי של עצב הראייה. הכללת היבטים מתודולוגיים אלה תסייע לשחזר תוצאות של פתולוגיות RPE עבור חוקרים כפי שהם עובדים עם מודלים עכבר AMD שלהם.

חוקרים עשויים לרצות להוסיף תכונות אנליטיות יותר לפרוטוקול פנוטיפ RPE. חלק מהתוצאות הפנוטיפיות שאינן מופיעות בפרוטוקול זה הן בחינת עובי BrM, מיקרוווילי אפיקלי RPE ורכיבים אולטרה-מבניים אחרים של RPE. רכיבים אלה כוללים מיטוכונדריה, גרגרי פיגמנט ואברונים אחרים כמו פגוזומים. חוקרים יכולים לקבוע את הגודל והמספר של רכיבים אלה במיקרוגרפים אלקטרונים המתקבלים באמצעות פרוטוקול זה באמצעות תוכנית פיג'י ImageJ. בפרט, מצב המיטוכונדריה עשוי להיות תוצאה פנוטיפית חשובה שיש לקחת בחשבון, שכן התמקדות במיטוכונדריה ב-RPE היא אסטרטגיה טיפולית חשובה עבור AMD36. תוצאה פנוטיפית נוספת היא מדידות נוספות של דיסמורפיה RPE על תושבות RPE שטוחות. תמונות RPE להרכבה שטוחה המתקבלות באמצעות הפרוטוקול ניתנות לבדיקה עבור צורת משושה RPE, מספר תאי RPE שכנים ומאפיינים אחרים באמצעות תוכנית REShAPE (https://github.com/nih-nei/REShAPE)35. תוצאה פנוטיפית אפשרית נוספת היא האם פתולוגיות RPE מתרחשות באזורים המרכזיים או ההיקפיים של רשתית העכבר. שיקולים פנוטיפיים נוספים אלה יחזקו עוד יותר את פרוטוקול הפנוטיפ RPE המתואר במאמר זה.

ישנן מספר מגבלות של פרוטוקול פנוטיפ RPE זה. מגבלה אחת של שיטה זו היא הצורך להקריב עכברים כדי לקצור את עיניהם עבור פנוטיפ RPE. כחלופה, פיתוחים חדשים בתחום הספקטרלי של טומוגרפיית קוהרנטיות אופטית (SD-OCT) מאפשרים כימות של עובי RPE ופתולוגיות בעכברים חיים37-39. זה עשוי להיות יתרון לחוקרים שרוצים לבצע מחקרי אורך על קבוצות מודל העכבר AMD שלהם. מגבלה נוספת של שיטה זו היא היעדר הערכות RPE תפקודיות בעכברים. אם החוקרים מעוניינים בהערכה תפקודית של RPE בעכברים, אנו ממליצים לבצע אלקטרורטינוגרפיה ולמדוד את רכיב גל c, שכן גל C מעיד על התפקיד התפקודי של RPE בפוטוטרנסדוקציה40. מגבלה נוספת של שיטה זו היא היעדר מדידות ביוכימיות של סמני RPE בעכברים. אם החוקרים רוצים לחקור את הרמות של סמני RPE, כגון חלבון קושר רטינאלדהיד תאי (CRABLP), חלבון אפיתל אפיתל ספציפי לרשתית 65 kDa (RPE65), אשלגן המתקן כלפי פנים את תת-משפחת J חבר 13 (KCNJ13), או בסטרופין 1 (BEST1), אנו ממליצים לקצור עיניים לאימונוהיסטוכימיה, PCR כמותי בזמן אמת או ניתוח כתמים מערביים.

לסיכום, פרוטוקול פנוטיפ RPE זה יכול להיות משאב חשוב עבור חוקרים המשתמשים במודלים עכבריים המסכמים היבטים פתולוגיים של AMD. פרוטוקול זה משמש גם לסטנדרטיזציה של אופן הערכת RPE בדגמי עכברים של AMD, דבר שלא תואר בעבר בספרות. סטנדרטיזציה של פנוטיפ RPE תהיה קריטית בתרגום הממצאים מעכברים למודלים אחרים של AMD, כולל מודלים של תרביות תאי RPE4 ומעלה כולל פרימטים לא אנושיים. זה גם יעזור לנו להבין את המנגנונים הפתוביולוגיים העומדים בבסיס פיתוח AMD ואולי לפתח טיפולים חדשים למחלה מסנוורת זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברי פרוטוקול זה אין גילויים וניגודי אינטרסים.

Acknowledgments

המחברים רוצים להודות לסאטושי קינושיטה ולאוניברסיטת ויסקונסין (UW) יוזמות מחקר תרגומי במעבדה לפתולוגיה (TRIP) על הכנת הרקמות שלנו למיקרוסקופ אור. ליבה זו נתמכת על ידי המחלקה לפתולוגיה ורפואת מעבדה באוניברסיטת UW, המרכז לסרטן פחמן באוניברסיטת ויסקונסין (P30 CA014520), ומשרד מנהל NIH (S10OD023526). מיקרוסקופיה קונפוקלית בוצעה בליבה האופטית של UW Biochemistry, שהוקמה בתמיכת המחלקה לביוכימיה של UW. עבודה זו נתמכה גם על ידי מענקים מהמכון הלאומי לעיניים (R01EY022086 ל A. Ikeda; R01EY031748 אל C. Bowes Rickman; P30EY016665 למחלקה לרפואת עיניים ומדעי הראייה באוניברסיטת וושינגטון; P30EY005722 למרכז דיוק איי; NIH T32EY027721 למ. לנדובסקי; F32EY032766 למ. לנדובסקי), טימותי ויליאם טראוט יו"ר (א. איקדה), פרס AMD של FFB Free Family (C. Bowes Rickman); ומענק בלתי מוגבל מהמחקר למניעת עיוורון (מרכז דיוק לעיניים).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 M Cacodylate Buffer pH7.2 PolyScientiifc R&D Company S1619
100 Capacity Slide Box Two are needed for this protocol (one for H&E-stained slides and one for RPE flat mounts.)
100% Ethanol  MDS Warehouse 2292-CASE Can be used to make diluted ethanol solutions in this protocol.
1-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks Qosina 11069
1x Phosphate Buffer Solution (PBS) Premade 1x PBS can be used in this protocol. 
2.0 mL microtubes Genesee Scientific  24-283-LR
24 Cavity Embedding Capsule Substitute Mold Electron Microscopy Sciences 70165
24 inch PVC Tubing with Luer Ends Fisher Scientific NC1376778
400 Mesh Gilder Thin Bar Square Mesh Grids Electron Microscopy Sciences T400-Cu
95% Ethanol MDS Warehouse 2293-CASE
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier (23 inches by 24 inches) VWR 56616-031
Adjustable 237 ml  Spray Bottle VWR 23609-182
Alexa Fluor488 Conjugated Donkey anti-Rabbit IgG  Thermo Fisher Scientific A-21206
Aluminum Foil
BD Precision glide 19 Gauge Syringe Needle Sigma-Aldrich  Z192546
Bracken Forceps; Curved; Fine Cross Serrations; 4" Length, 1 mm Tip Width Roboz Surgical Instrument RS-5211 Known as curved forceps in this protocol.
Camel Hair Brush Electron Microscopy Sciences 65575-02
Carbon Dioxide Euthanasia Chamber
Carbon Dioxide Flow Meter
Carbon Dioxide Tank
Castaloy Prong Extension Clamps Fisher Scientific  05-769-7Q
Cast-Iron L-shaped Base Support Stand Fisher Scientific  11-474-207
Cell Prolifer Program Available to download: https://cellprofiler.org/releases
Clear Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180
Colorfrost Microscope Slides Lavender VWR 10118-956
Computer
DAPI Sigma-Aldrich D9542-5MG
Distilled H20 Water from Milli-Q Purification System was used in this protocol.
Dumont Thin Tip Tweezers; Pattern #55 Roboz Surgical Instrument RS-4984 Known as fine-tipped forceps in this protocol, and 3 are needed for this protocol (two for dissections and one for electron microscope processing).
Electron Microscopy Grid Holder Electron Microscopy Sciences 71147-01
EPON 815 Resin Electron Microscopy Sciences 14910
Epredia Mark-It Tissue Marking Yellow Dye Fisher Scientific  22050460 Please follow manufacturer's protocol when using this tissue marking dye. 
Epredia Mounting Media Fisher Scientific 22-110-610 Use for mounting H&E slides. 
Fiber-Lite Mi-150 Illuminator Series,150 w Halogen Light Source Dolan-Jenner Industries Mi-150 Light source for dissecting microscope.
Fiji ImageJ Program Available to download: https://imagej.net/downloads
Flexaframe Castaloy Hook Connector Thermo Scientific   14-666-18Q
Fume hood
Glutaraldehyde 2.5% in Phosphate Buffer, pH 7.4, 32% Electron Microscopy Sciences 16537-05
JEM-1400 Transmission Electron Microscope (JEOL) with an ORIUS (1000) CCD Camera
Laboratory Benchtop Shaker Two are needed for these experiments. One should be at room temperature while the other should be in a 4 degree Celsius cold room.
Laser Cryo Tag Labels Electron Microscopy Sciences 77564-05
Lead Citrate Electron Microscopy Sciences 17800
Leica EM UC7Ultramicrotome
Leica Reichert Ultracut S Microtome
LifterSlips Thermo Fisher Scientific 22X22I24788001LS Use these coverslips for the RPE flat mounts as they have raised edges and accommodate the thickness of the RPE.
Mayer's Hematoxylin VWR 100504-406
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors Roboz Surgical Instrument RS-5600 Known as micro-dissecting scissors in protocol. 
Methanol Fisher Scientific  A412-4
Mice Any AMD mouse model and its respective controls can work for this protocol.
Micro Dissecting Scissors; Standard Version; Curved; Sharp Points; 24 mm Blade Length; 4.5" Overall Length Roboz Surgical Instrument RS-5913 Known as curved scissors in this protocol.
Microsoft Excel
Microtube racks
Nikon A1RS Confocal Microscope
Normal Donkey Serum SouthernBiotech 0030-01
Number 11 Sterile Disposable Scalpel Blades VWR 21909-380
Osmium Tetroxide  Electron Microscopy Sciences 19150
Paraformaldehyde, 32% Electron Microscopy Sciences 15714-S
Pencil
Petri Dish VWR  21909-380
Pipette Tips
Pipettes 
Polyclonal Anti-ZO-1 Antibody Thermo Fisher Scientific 402200
Propylene Oxide Electron Microscopy Sciences 20412
Razor Blade VWR 10040-386
Shallow Tray for Mouse Perfusions
Shandon Eosin Y Alcoholic VWR 89370-828
Sharpie Ultra Fine Tip Black Permanent Marker Staples 642736
Slide Rack for Staining Grainger 49WF31
Squared Cover Glass Slips Fisher Scientific  12-541B
Staining Dish with Cover Grainger 49WF30 Need 15 for H&E staining procedure.
Target All-Plastic Disposable Luer-Slip 50 mL Syringe  Thermo Scientific  S7510-50 Use only the syringe barrel.
Timer Fisher 1464917
Uranyl Acetate Electron Microscopy Sciences 22400
Vacuum Oven
Vectashield Mounting Medium Vector Laboratories H-1000 Use for mounting RPE flat mounts. 
Xylene Fisher Scientific  22050283
Zeiss Axio Imager 2 Light Microscope This microscope has the capacity to generate stitched 20x images. If a light microscope does not have this capacity, then take images of the entire retina that are slightly overlapping each other. Use Adobe Photoshop to stitch these images together. Please refer to the manuals of the Adobe Photoshop program for image stitching. 
Zeiss Stemi 2000 Dissecting Microscope Electron Microscopy Sciences 65575-02

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet. Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).
  2. Bhutto, I., Lutty, G. Understanding age-related macular degeneration (AMD): relationships between the photoreceptor/retinal pigment epithelium/Bruch's membrane/choriocapillaris complex. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 295-317 (2012).
  3. Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progess in Retinal and Eye Research. 100846, (2020).
  4. Bharti, K., et al. Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 222, 109170 (2022).
  5. Forest, D. L., Johnson, L. V., Clegg, D. O. Cellular models and therapies for age-related macular degeneration. Disease Models & Mechanisms. 8 (5), 421-427 (2015).
  6. Landowski, M., Bowes Rickman, C. Targeting lipid metabolism for the treatment of age-related macular degeneration: Insights from preclinical mouse models. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 38 (1), 3-32 (2022).
  7. Pennesi, M. E., Neuringer, M., Courtney, R. J. Animal models of age related macular degeneration. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 487-509 (2012).
  8. Malek, G., Busik, J., Grant, M. B., Choudhary, M. Models of retinal diseases and their applicability in drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 13 (4), 359-377 (2018).
  9. Cao, D., et al. Hyperreflective foci, optical coherence tomography progression indicators in age-related macular degeneration, include transdifferentiated retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 62 (10), 34 (2021).
  10. Ding, J. D., et al. Expression of human complement factor H prevents age-related macular degeneration-like retina damage and kidney abnormalities in aged Cfh knockout mice. The American Journal of Pathology. 185 (1), 29-42 (2015).
  11. Zanzottera, E. C., et al. The project MACULA retinal pigment epithelium grading system for histology and optical coherence tomography in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 56 (5), 3253-3268 (2015).
  12. Ding, J. D., et al. Anti-amyloid therapy protects against retinal pigmented epithelium damage and vision loss in a model of age-related macular degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (28), 279-287 (2011).
  13. Zhang, Q., et al. Comparison of histologic findings in age-related macular degeneration with RPE flatmount images. Molecular Vision. 25, 70-78 (2019).
  14. vonder Emde, L., et al. Histologic cell shape descriptors for the retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: A comparison to unaffected eyes. Translational Vision Science & Technology. 11 (8), 19 (2022).
  15. Gambril, J. A., et al. Quantifying retinal pigment epithelium dysmorphia and loss of histologic autofluorescence in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 60 (7), 2481-2493 (2019).
  16. Bird, A. C., Phillips, R. L., Hageman, G. S. Geographic atrophy: a histopathological assessment. JAMA Ophthalmology. 132 (3), 338-345 (2014).
  17. Zanzottera, E. C., et al. Visualizing retinal pigment epithelium phenotypes in the transition to geographic atrophy in age-related macular degeneration. Retina. 36, 12-25 (2016).
  18. Sura, A. A., et al. Measuring the contributions of basal laminar deposit and Bruch's membrane in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 61 (13), 19 (2020).
  19. Curcio, C. A. Soft drusen in age-related macular degeneration: biology and targeting via the oil spill strategies. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 59 (4), 160 (2018).
  20. Johnson, M., et al. Comparison of morphology of human macular and peripheral Bruch's membrane in older eyes. Current Eye Research. 32 (9), 791-799 (2007).
  21. Sarks, S. H., Arnold, J. J., Killingsworth, M. C., Sarks, J. P. Early drusen formation in the normal and aging eye and their relation to age related maculopathy: a clinicopathological study. The British Journal of Ophthalmology. 83 (3), 358-368 (1999).
  22. Chen, L., Messinger, J. D., Kar, D., Duncan, J. L., Curcio, C. A. Biometrics, impact, and significance of basal linear deposit and subretinal drusenoid deposit in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 62 (1), 33 (2021).
  23. Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).
  24. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protocols. 2008, (2008).
  25. Cornell, W. C., et al. Paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis. Journal of Visualized Experiments. (133), e57196 (2018).
  26. Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. Journal of Visualized Experiments. (139), e58288 (2018).
  27. Baena, V., Schalek, R. L., Lichtman, J. W., Terasaki, M. Serial-section electron microscopy using automated tape-collecting ultramicrotome (ATUM). Methods in Cell Biology. 152, 41-67 (2019).
  28. Yamaguchi, M., Chibana, H. A method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (131), e56235 (2018).
  29. Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433 (2021).
  30. Landowski, M., et al. Modulation of Tmem135 leads to retinal pigmented epithelium pathologies in mice. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 61 (12), 16 (2020).
  31. Mori, H., et al. Developmental and age-related changes to the elastic lamina of Bruch's membrane in mice. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (2), 289-301 (2019).
  32. Chen, M., et al. Retinal pigment epithelial cell multinucleation in the aging eye - a mechanism to repair damage and maintain homoeostasis. Aging Cell. 15 (3), 436-445 (2016).
  33. Ortín-Martínez, A., et al. Number and distribution of mouse retinal cone photoreceptors: differences between an albino (Swiss) and a pigmented (C57/BL6) strain. PLoS One. 9 (7), 102392 (2014).
  34. El-Danaf, R. N., Huberman, A. D. Sub-topographic maps for regionally enhanced analysis of visual space in the mouse retina. The Journal of Comparative Neurology. 527 (1), 259-269 (2019).
  35. Ortolan, D., et al. Single-cell-resolution map of human retinal pigment epithelium helps discover subpopulations with differential disease sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (19), 2117553119 (2022).
  36. Brown, E. E., Lewin, A. S., Ash, J. D. Mitochondria: Potential targets for protection in age-related macular degeneration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 11-17 (2018).
  37. Puk, O., De Angelis, M. H., Graw, J. Longitudinal fundus and retinal studies with SD-OCT: a comparison of five mouse inbred strains. Mammalian Genome. 24 (5-6), 198-205 (2013).
  38. Knott, E. J., Sheets, K. G., Zhou, Y., Gordon, W. C., Bazan, N. G. Spatial correlation of mouse photoreceptor-RPE thickness between SD-OCT and histology. Experimental Eye Research. 92 (2), 155-160 (2011).
  39. Allen, R. S., Bales, K., Feola, A., Pardue, M. T. In vivo structural assessments of ocular disease in rodent models using optical coherence tomography. Journal of Visualized Experiments. (161), e61588 (2020).
  40. Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).

Tags

החודש ב-JoVE גיליון 193
פרוטוקול להערכה וכימות של פתולוגיות אפיתל פיגמנטי ברשתית במודלים עכבריים של ניוון מקולרי הקשור לגיל
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Landowski, M., Grindel, S., Hao, Y., … More

Landowski, M., Grindel, S., Hao, Y., Ikeda, S., Bowes Rickman, C., Ikeda, A. A Protocol to Evaluate and Quantify Retinal Pigmented Epithelium Pathologies in Mouse Models of Age-Related Macular Degeneration. J. Vis. Exp. (193), e64927, doi:10.3791/64927 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter