Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Un protocollo per valutare e quantificare le patologie dell'epitelio pigmentato retinico in modelli murini di degenerazione maculare legata all'età

Published: March 10, 2023 doi: 10.3791/64927
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 1,2, 3,4, 1,2
1Department of Medical Genetics, University of Wisconsin-Madison, 2McPherson Eye Research Institute, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Ophthalmology, Duke University, 4Department of Cell Biology, Duke University

Summary

I modelli murini possono essere strumenti utili per studiare la biologia dell'epitelio pigmentato retinico (RPE). È stato stabilito che i topi possono sviluppare una serie di patologie RPE. Qui, descriviamo un protocollo di fenotipizzazione per chiarire e quantificare le patologie RPE nei topi utilizzando luce, elettrone di trasmissione e microscopia confocale.

Abstract

La degenerazione maculare legata all'età (AMD) è una malattia debilitante della retina nelle popolazioni che invecchiano. È opinione diffusa che la disfunzione dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) sia un evento patobiologico chiave nell'AMD. Per comprendere i meccanismi che portano alla disfunzione RPE, i modelli murini possono essere utilizzati dai ricercatori. È stato stabilito da studi precedenti che i topi possono sviluppare patologie RPE, alcune delle quali sono osservate negli occhi di individui con diagnosi di AMD. Qui, descriviamo un protocollo di fenotipizzazione per valutare le patologie RPE nei topi. Questo protocollo include la preparazione e la valutazione delle sezioni trasversali retiniche mediante microscopia ottica e microscopia elettronica a trasmissione, nonché quella dei supporti piani RPE mediante microscopia confocale. Descriviamo in dettaglio i tipi comuni di patologie RPE murine osservate da queste tecniche e i modi per quantificarle attraverso metodi imparziali per i test statistici. Come prova del concetto, utilizziamo questo protocollo di fenotipizzazione RPE per quantificare le patologie RPE osservate nei topi che sovraesprimono la proteina transmembrana 135 (Tmem135) e nei topi C57BL/6J wild-type invecchiati. L'obiettivo principale di questo protocollo è quello di presentare metodi standard di fenotipizzazione RPE con valutazioni quantitative imparziali per gli scienziati che utilizzano modelli murini di AMD.

Introduction

La degenerazione maculare legata all'età (AMD) è una malattia accecante comune che colpisce le popolazioni di età superiore ai 55anni 1. Molti ricercatori ritengono che la disfunzione all'interno dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) sia un evento patobiologico precoce e cruciale nell'AMD2. L'RPE è un monostrato di cellule polarizzate che ha il compito di mantenere l'omeostasi dei fotorecettori vicini e dei vasi sanguigni coroideali3. Esistono vari modelli per studiare i meccanismi associati alla malattia all'interno dell'RPE, compresi i modelli di coltura cellulare 4,5 e topi 6,7,8. Un recente rapporto ha descritto protocolli standardizzati e criteri di controllo della qualità per i modelli di coltura cellulare RPE4, ma nessun rapporto ha tentato di standardizzare la fenotipizzazione dell'RPE nei modelli murini. In effetti, molte pubblicazioni su modelli murini di AMD mancano di una descrizione completa dell'RPE o della quantificazione delle patologie RPE in essi. L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di presentare metodi standard di fenotipizzazione RPE con valutazioni quantitative imparziali per gli scienziati che utilizzano modelli murini AMD.

Pubblicazioni precedenti hanno notato la presenza di diverse patologie RPE nei topi attraverso tre tecniche di imaging. Ad esempio, la microscopia ottica consente ai ricercatori di visualizzare la morfologia grossolana della retina murina (Figura 1A) e rilevare patologie RPE come assottigliamento RPE, vacuolizzazione e migrazione. L'assottigliamento dell'RPE in un modello di mouse AMD è esemplificato da una deviazione nell'altezza dell'RPE dai rispettivi controlli (Figura 1B). La vacuolizzazione RPE può essere suddivisa in due categorie separate: microvacuolizzazione (Figura 1C) e macrovacuolizzazione (Figura 1D). La microvacuolizzazione RPE è riassunta dalla presenza di vacuoli nell'RPE che non influiscono sulla sua altezza complessiva, mentre la macrovacuolizzazione è indicata dalla presenza di vacuoli che sporgono nei segmenti esterni dei fotorecettori. La migrazione RPE si distingue per l'aggregato focale di pigmento sopra il monostrato RPE in una sezione trasversale retinica (Figura 1E). Va notato che le cellule RPE migratorie negli occhi dei donatori di AMD mostrano immunoreattività ai marcatori delle cellule immunitarie, come il cluster di differenziazione 68 (CD68)9, e potrebbero rappresentare cellule immunitarie che inghiottono detriti RPE o RPE in fase di transdifferenziazione 9. Un'altra tecnica di imaging chiamata microscopia elettronica a trasmissione può consentire ai ricercatori di visualizzare l'ultrastruttura dell'RPE e la sua membrana basale (Figura 2A). Questa tecnica può identificare il deposito sub-RPE predominante nei topi, noto come deposito laminare basale (BLamD) (Figura 2B)10. Infine, la microscopia confocale può rivelare la struttura delle cellule RPE attraverso l'imaging di supporti piatti RPE (Figura 3A). Questo metodo può scoprire la dismorfia RPE, la deviazione dell'RPE dalla sua classica forma a nido d'ape (Figura 3B). Può anche rilevare la multinucleazione RPE, la presenza di tre o più nuclei all'interno di una cellula RPE (Figura 3C). Per una sintesi dei tipi di patologie RPE presenti negli attuali modelli murini AMD, rimandiamo i ricercatori a queste recensioni dalla letteratura 6,7.

I ricercatori che studiano l'AMD dovrebbero essere consapevoli dei vantaggi e degli svantaggi dell'uso dei topi per studiare le patologie RPE prima del protocollo di fenotipizzazione. I topi sono vantaggiosi a causa della loro durata di vita relativamente breve e del rapporto costo-efficacia, nonché della loro manipolabilità genetica e farmacologica. I topi mostrano anche cambiamenti degenerativi RPE, tra cui migrazione RPE, dismorfia e multinucleazione, che si osservano negli occhi dei donatori di AMD 11,12,13,14,15,16,17; ciò suggerisce che meccanismi simili possono essere alla base dello sviluppo di queste patologie RPE nei topi e negli esseri umani. Tuttavia, ci sono differenze chiave che limitano la traducibilità degli studi sui topi all'AMD umana. In primo luogo, i topi non hanno una macula, una regione anatomicamente distinta della retina umana necessaria per l'acuità visiva che è preferenzialmente influenzata nell'AMD. In secondo luogo, alcune patologie RPE nei topi, come l'assottigliamento e la vacuolizzazione dell'RPE, non sono tipicamente osservate negli occhi dei donatori di AMD18. In terzo luogo, i topi non sviluppano drusen, un segno distintivo della patologia AMD19. Le drusen sono depositi contenenti lipidi e proteine con pochissime proteine di membrana basale che si formano tra la lamina basale RPE e lo strato collagenoso interno della membrana di Bruch (BrM)19. Drusen differisce da BLamD, il comune deposito sub-RPE nei topi, sia nella loro composizione che nella posizione anatomica. Le BLamD sono anomalie arricchite dalla matrice extracellulare dipendenti dall'età e dallo stress che si formano tra la lamina basale RPE di BrM e le pieghe basali dell'RPE20. È interessante notare che i BLamD hanno una composizione proteica e un aspetto simili sia nei topi che negli esseri umani 6,10,21. Lavori recenti suggeriscono che i BLamD possono agire nella patobiologia dell'AMD influenzando la progressione dell'AMD fino alle sue fasi successive18,22; pertanto, questi depositi possono rappresentare RPE malato nella retina del topo. La conoscenza di questi benefici e limitazioni è fondamentale per i ricercatori interessati a tradurre i risultati degli studi sui topi in AMD.

In questo protocollo, discutiamo i metodi per preparare gli occhi alla luce, alla trasmissione elettronica e alla microscopia confocale per visualizzare le patologie RPE. Descriviamo anche come quantificare le patologie RPE in modo imparziale per i test statistici. Come prova del concetto, utilizziamo il protocollo di fenotipizzazione RPE per studiare le patologie strutturali RPE osservate nei topi sovraesprimenti della proteina transmembrana 135- (Tmem135) e nei topi C57BL / 6J wild-type (WT) invecchiati. In sintesi, ci proponiamo di descrivere la metodologia di fenotipizzazione per caratterizzare l'RPE nei modelli murini AMD, poiché attualmente non sono disponibili protocolli standard. I ricercatori interessati a esaminare e quantificare le patologie dei fotorecettori o della coroide, che sono anche interessati nei modelli murini AMD, potrebbero non trovare questo protocollo utile per i loro studi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee presso l'Università del Wisconsin-Madison e sono in aderenza con la dichiarazione dell'Associazione per la ricerca in visione e oftalmologia (ARVO) per l'uso di animali nella ricerca oftalmica e visiva.

1. Valutazione dell'RPE del mouse mediante microscopia ottica

  1. Fare un tampone fissativo che abbia una concentrazione finale del 2% di paraformaldeide e del 2% di glutaraldeide a temperatura ambiente (RT) in una bottiglia di vetro.
    NOTA: questo protocollo richiede, al massimo, 14 mL di buffer fissativo per mouse.
    ATTENZIONE: Paraformaldeide e glutaraldeide sono sostanze pericolose. Si prega di seguire le procedure operative standard quando si lavora con queste sostanze.
  2. Preparare un sistema di perfusione per gravità su un sottoscocca assorbente per la perfusione cardiaca in una cappa aspirante (figura supplementare 1A).
    1. Introdurre 40 mL del tampone fissativo nel cilindro della siringa del sistema di perfusione (figura supplementare 1B).
    2. Ruotare la valvola fino a quando non è parallela alla tubazione per consentire al tampone di fluire attraverso la linea di tubi (figura supplementare 1C). Lavare la linea con buffer fino a quando tutte le bolle d'aria vengono rimosse dalla linea.
    3. Ruotare la valvola fino a renderla perpendicolare alla tubazione per impedire al buffer di fluire nella linea dei tubi (Figura supplementare 1D).
      NOTA: Il sistema di perfusione è ora pronto per l'uso.
  3. Eutanasia del topo mettendolo in una camera di anidride carbonica (CO 2) e consentire alla CO2 di fluire nella camera ad una velocità del 30% del volume della camera al minuto. Una volta che il topo smette di respirare, lasciare che la CO2 fluisca nella camera per almeno 1 minuto. Verificare che il mouse sia morto prima di andare al passaggio successivo.
    NOTA: L'eutanasia attraverso l'iniezione di agenti farmacologici può essere utilizzata in questo protocollo come alternativa all'inalazione di CO2 .
  4. Eseguire la perfusione cardiaca sul topo eutanasia.
    1. Trasferire il mouse su un vassoio poco profondo vicino al sistema di perfusione con l'addome rivolto verso l'alto. Spruzzare l'addome con etanolo al 70% (EtOH).
    2. Fare quattro incisioni per esporre la cavità addominale (Figura supplementare 2A).
      1. Crea un taglio inferiore di 5 cm usando forbici curve e pinze attraverso la pelle e la parete addominale sul lato sinistro più lontano del mouse che si trova direttamente sotto la gabbia toracica.
      2. Procedere a fare un taglio mediale di 3 cm attraverso la pelle e la parete addominale del topo che inizia nella parte superiore del taglio inferiore.
      3. Fai un altro taglio inferiore di 5 cm alla fine del taglio mediale attraverso la pelle e la parete addominale sul lato destro del mouse direttamente sotto la gabbia toracica.
      4. Fare un'altra incisione mediale di 3 cm per rimuovere il lembo della pelle addominale con una pinza curva.
    3. Tagliare il diaframma e lo sterno per esporre il cuore (Figura supplementare 2B).
      NOTA: Fare attenzione a evitare di scalfire il cuore, le arterie e le vene. Nicking questi porterà a una perfusione cardiaca inefficiente.
    4. Inserire l'ago del misuratore nel ventricolo sinistro del cuore. Ruotare la valvola fino a quando non è parallela alla linea del tubo. Tagliare l'atrio destro con forbici curve per consentire al sangue e al fissativo di uscire dal cuore (Figura supplementare 2C).
    5. Lasciare penetrare 10 ml di tampone fissativo nel topo per almeno 1-2 minuti, o fino a quando il fegato diventa di colore pallido e nessun sangue fuoriesce dall'atrio destro. Una volta completata la perfusione, ruotare la valvola fino a renderla perpendicolare alla linea del tubo per arrestare il flusso del tampone.
  5. Enucleare gli occhi dal topo dopo perfusione cardiaca.
    1. Rimuovere il mouse dal vassoio poco profondo e posizionare il mouse sul sottoscocca assorbente in una cappa aspirante. Orientare la testa del topo in modo che l'occhio sinistro sia rivolto verso lo sperimentatore e l'occhio destro sia fuori dalla vista. Annotare il lato superiore dell'occhio con un colorante per la marcatura dei tessuti.
    2. Spingere delicatamente verso il basso con il pollice e l'indice attorno all'orbita oculare per provocare la sporgenza dell'occhio dall'orbita oculare (Figura supplementare 3A).
    3. Prendi le forbici curve e tienile con la lama con un angolo di 30° dall'orbita oculare. Procedere al taglio intorno all'occhio con le forbici curve con un angolo di 30° (Figura supplementare 3B).
      NOTA: Va bene tagliare il tessuto in eccesso dall'orbita oculare per preservare l'integrità del bulbo oculare.
    4. Rimuovere il bulbo oculare dalla testa con una pinza curva e posizionarlo su un sottoscocca assorbente. Tagliare la cornea con una lama di bisturi numero 11 e posizionare l'occhio con una pinza curva in un microtubo da 2 ml con 2 ml di tampone fissativo. Etichettare il microtubo da 2 mL con l'identificazione del mouse e "sinistra" per indicare l'occhio sinistro.
      NOTA: Il nick nella cornea consente al fissativo di penetrare facilmente nell'occhio per preservarlo meglio.
    5. Ripetere i passaggi 1.5.1-1.5.4 per l'occhio destro.
  6. Lasciare che gli occhi incubino in tampone fissativo durante la notte su uno shaker in una stanza a 4 ° Celsius (C), ad una velocità di 75 rotazioni al minuto (rpm).
  7. Sostituire il tampone fissativo con 2 mL di 1x tampone fosfato salino (PBS). Incubare gli occhi in 1x PBS per 10 minuti su uno shaker a RT e 75 rpm. Ripetere questo passaggio due volte.
  8. Pulire e sezionare gli occhi per generare segmenti posteriori.
    NOTA: Il segmento posteriore è il bulbo oculare del topo con la retina neurale, RPE, coroide e sclera senza cornea, iride e lente.
    1. Posizionare l'occhio in una capsula di Petri riempita con 1x PBS al microscopio da dissezione (Figura supplementare 4A).
    2. Sollevare delicatamente il grasso e il muscolo lontano dal bulbo oculare con una pinza a punta fine. Tagliare con cura il grasso e il muscolo con forbici micro-dissecanti in direzione parallela al bulbo oculare fino a quando il bulbo oculare ha un colore bluastro-nero uniforme (Figura supplementare 4B).
      NOTA: Non tagliare in direzione perpendicolare, poiché ciò danneggia il bulbo oculare. Inoltre, se il colorante per la marcatura dei tessuti si stacca durante la lavorazione, annotare immediatamente il lato superiore del bulbo oculare.
    3. Posizionare una pinza a punta fine nel sito di puntura corneale. Tagliare attorno al perimetro della cornea, iniziando dal sito di puntura, con forbici micro-dissecanti, per rimuovere la cornea e l'iride dal bulbo oculare (Figura supplementare 4C).
    4. Prendere una pinza a punta fine e rimuovere delicatamente la lente dal bulbo oculare per ottenere il segmento posteriore (Figura supplementare 4D).
    5. Inserire nuovamente il segmento posteriore in un microtubo da 2 mL con 2 mL di 1x PBS. Conservare il segmento posteriore in frigorifero a 4 °C.
      NOTA: I segmenti posteriori possono rimanere in 1x PBS a 4 °C per molte settimane prima di un'ulteriore elaborazione.
  9. Ripetere i passaggi 1.3-1.8 per preparare gli occhi da altri topi nello studio.
  10. Elaborare e incorporare uno dei segmenti posteriori di ciascun topo in paraffina per il sezionamento. Assicurati che il lato superiore del segmento posteriore sia in alto.
    NOTA: Gli autori si affidano al laboratorio TRIP (Translational Research Initiatives in Pathology) dell'Università del Wisconsin-Madison (UW) per eseguire questi compiti. Qui sono pubblicati protocolli che utilizzano un metodo simile di elaborazione e incorporamento della paraffina23,24.
  11. Tagliare e sezionare ogni blocco di paraffina per ottenere una sezione retinica spessa 5 μm che includa la testa del nervo ottico, nonché quattro sezioni retiniche aggiuntive spesse 5 μm che distano 250 μm l'una dall'altra. Etichettare le diapositive con l'identificazione del mouse e il numero di serie della sezione (ad esempio, 1, 2, 3, 4 o 5). Archiviare le diapositive in una casella diapositiva.
    NOTA: Gli autori si affidano al laboratorio UW TRIP per i loro servizi nel sezionamento della paraffina. Qui sono pubblicati protocolli che utilizzano un metodo di sezionamento della paraffina simile25,26.
  12. Colorare i vetrini contenenti sezioni retiniche con ematossilina ed eosina (H&E). Un protocollo di colorazione H&E può essere trovato nella Figura supplementare 5.
    NOTA: Tutte le fasi della procedura di colorazione H&E devono essere completate in una cappa aspirante.
  13. Raccogli immagini cucite di sezioni retiniche colorate con H & E con una barra della scala utilizzando un microscopio ottico con ingrandimento 20x.
  14. Quantificare lo spessore RPE nelle immagini retiniche contenenti la testa del nervo ottico per ciascun campione.
    1. Scarica e apri il programma Fiji ImageJ. Trascinare tutte le immagini della retina cucite contenenti la testa del nervo ottico nella barra delle applicazioni Fiji ImageJ. Verifica che la scala dell'immagine sia calibrata in μm e non in pixel.
      NOTA: la scala dell'immagine si trova nell'angolo superiore sinistro della finestra contenente un'immagine retinica nel programma Fiji ImageJ. Se la scala è impostata in pixel, fare riferimento al manuale di istruzioni del programma Fiji ImageJ per convertire i pixel in μm.
    2. Segnare ogni intervallo di 300 μm in ogni immagine dal bordo della testa del nervo ottico alla fine della retina (ora serrata). Fare clic sull'icona Dritto nella barra delle applicazioni Fiji ImageJ. Fare clic e trascinare una linea dal bordo della testa del nervo ottico verso l'ora serrata che è lunga 300 μm. Fare clic sullo strumento Pennello nella barra delle applicazioni Fiji ImageJ e fare clic sulla fine della linea di 300 μm per contrassegnarla.
    3. Misurare lo spessore RPE ad ogni intervallo contrassegnato. Fare clic sull'icona Dritto nella barra delle applicazioni Fiji ImageJ. Fare clic e trascinare una linea dall'alto verso il basso dell'RPE (Figura 6 supplementare). Fare clic su Analizza > misura nella barra dei menu Fiji ImageJ per ottenere lo spessore RPE.
    4. Trasferire le misure di spessore RPE in un foglio di calcolo ed etichettare la colonna contenente le misurazioni con l'identificazione del mouse. Etichetta una colonna aggiuntiva con "Intervallo marcato" e inserisci la distanza dai valori del nervo ottico (ad esempio, 300, 600, 900, ecc.)
      NOTA: Il primo intervallo misurato corrisponde a 300 μm di distanza dal nervo ottico, il secondo intervallo misurato corrisponde a 600 μm di distanza e così via.
  15. Quantificare i tassi di incidenza della patologia RPE in base alle immagini retiniche per ciascun campione.
    1. Aprire il programma Fiji ImageJ.
    2. Aprire l'applicazione Cell Counter all'interno del programma Fiji ImageJ. Fare clic su Plugins > Analyze > Cell Counter nella barra dei menu Fiji ImageJ. Trascinare un'immagine retinica nella barra delle applicazioni Fiji ImageJ e fare clic su Inizializza nella finestra Cell Counter .
    3. Contare il numero di patologie RPE per sezione retinica utilizzando l'applicazione Cell Counter . Fare clic su Tipo 1 sotto Contatori e quindi fare clic su tutti gli eventi di microvacuolizzazione nell'immagine. Fare clic su Tipo 2 sotto Contatori e quindi fare clic su tutti gli eventi di macrovacuolizzazione nell'immagine. Fare clic su Tipo 3 sotto Contatori e quindi fare clic su tutti i singoli eventi di migrazione nell'immagine.
    4. Trasferire i numeri delle patologie RPE in un foglio di calcolo. Etichettare le righe con microvacuolizzazione, macrovacuolizzazione o migrazione e la colonna con l'identificazione del mouse.
    5. Ripetere i passaggi 1.15.2-1.15.4 per altre immagini del campione. Calcolare la media del numero di patologie RPE per campione e dividere per cinque per calcolare il tasso di incidenza di ciascuna patologia RPE per il campione nel foglio di calcolo.
  16. Eseguire analisi statistiche sugli spessori RPE ad ogni intervallo e sui tassi di incidenza della patologia RPE per determinare se ci sono differenze significative tra i gruppi nello studio.

2. Valutazione dell'RPE del topo mediante microscopia elettronica a trasmissione

  1. Tagliare gli altri segmenti posteriori ceduti dopo i passaggi 1,5-1,9 a metà attraverso il segno superiore in due sezioni con una lama di rasoio. Riannotare il lato superiore dei segmenti posteriori sezionati con colorante per marcatura tissutale. Separare i segmenti posteriori sezionati in nuovi microtubi da 2 mL contenenti 2 mL di 1x PBS e identificazione del mouse.
    NOTA: Il segmento posteriore del topo è troppo grande per essere elaborato in un unico pezzo e deve essere tagliato a metà per l'elaborazione al microscopio elettronico a trasmissione.
  2. Risciacquare i tessuti con 2 ml di tampone cacodilato da 0,1 M, pH 7,2. Incubare per 10 minuti a RT sul banco. Ripetere questo passaggio altre due volte.
  3. Sostituire il tampone cacodilato da 0,1 M con 2 ml di tetrossido di osmio al 2% (OsO4) diluito in tampone cacodidilato da 0,1 M. Incubare per 1,5 ore a RT nella cappa aspirante.
    ATTENZIONE: OsO4 è una sostanza velenosa. Si prega di seguire le procedure operative standard quando si lavora con OsO4.
  4. Risciacquare i fazzoletti con 2 ml di tampone cacodilato da 0,1 M per 10 minuti a RT nella cappa aspirante. Ripetere questo passaggio una volta.
  5. Disidratare i tessuti con diluizioni graduate di EtOH comprese tra il 50% e il 100% a RT nella cappa aspirante. Un protocollo per la procedura di disidratazione può essere trovato nella figura supplementare 7.
  6. Rimuovere il 100% di EtOH dai tessuti e aggiungere 2 ml di ossido di propilene ai tessuti. Incubare a RT nella cappa aspirante per 15 min. Rimuovere l'ossido di propilene dai tessuti e aggiungere 2 ml di ossido di propilene fresco ai tessuti. Incubare a RT nella cappa aspirante per 15 min.
    ATTENZIONE: L'ossido di propilene è una sostanza tossica. Si prega di seguire le procedure operative standard quando si lavora con ossido di propilene.
  7. Rimuovere l'ossido di propilene dai tessuti e aggiungere 2 ml di una miscela 1:1 di ossido di propilene e resina ai tessuti. Lasciare per una notte sotto l'aspirapolvere nella cappa aspirante di RT.
    ATTENZIONE: La resina è una sostanza pericolosa per l'uomo. Si prega di seguire le procedure operative standard del laboratorio quando si lavora con la resina.
  8. Sostituire la miscela 1:1 di ossido di propilene e resina dai tessuti con 2 ml di resina pura. Lasciare per una notte sotto l'aspirapolvere nella cappa aspirante di RT .
  9. Incorporare i tessuti in resina. Metti un'etichetta con l'identificazione del mouse a matita e una goccia di resina nello stampo . Posizionare il tessuto sulla goccia di resina. Riempire lo stampo con resina e metterlo sotto vuoto per 1 h a RT nella cappa aspirante.
  10. Riposizionare le etichette e i campioni con una pinza a punta fine, con il lato posteriore della sezione oculare posteriore sulla parte superiore. Lasciare lo stampo per una notte a 65 °C in forno nella cappa aspirante.
  11. Togliere gli stampi dal forno. Lasciare raffreddare gli stampi fino a RT sul piano di lavoro. Rimuovere i blocchi dagli stampi.
    NOTA: i blocchi sono ora pronti per il taglio.
  12. Modella i blocchi di resina con una lama di rasoio per formare un trapezio. Tagliare i blocchi di resina usando un microtomo fino a quando la testa del nervo ottico è visibile. Procedere all'uso di un coltello diamantato per tagliare sezioni semisottili dai blocchi di resina con uno spessore di 0,5 μm.
    NOTA: Ecco un protocollo pubblicato sulla sezione dei microtomi27. Se lo si desidera, è possibile raccogliere e colorare sezioni semisottili spesse 0,5 μm dai blocchi di resina per valutare l'integrità del campione.
  13. Tagliare una sezione ultrasottile spessa 70 nm da ciascun blocco tagliato usando un ultramicrotomo. Raccogliere una sezione ultrasottile spessa 70 nm su una griglia di rame a barra sottile a 400 maglie. Posizionare la griglia in una scatola di archiviazione della griglia ed etichettare lo slot con l'identificazione del mouse.
    NOTA: Ecco un protocollo pubblicato sulla sezione degli ultramicrotomi28.
  14. Colorare le griglie con acetato di uranile al 2% per 5 minuti e poi con una soluzione di citrato di piombo al 3,5% per 5 minuti a RT nella cappa aspirante.
    ATTENZIONE: L'acetato di uranile e il citrato di piombo sono sostanze pericolose. Si prega di seguire le procedure operative standard quando si lavora con queste sostanze.
  15. Ottieni immagini per ogni campione utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione con un ingrandimento di 15.000x, dove le linee della griglia di rame intersecano RPE e BrM.
    NOTA: ci dovrebbero essere almeno da 20 a 35 immagini per sezione e da 40 a 70 immagini per campione.
  16. Quantificare le altezze di BLamD nelle immagini per i campioni nello studio.
    1. Aprire il programma Fiji ImageJ. Trascinare tutte le immagini dalla sezione di esempio nella barra delle applicazioni Fiji ImageJ. Verifica che le immagini siano calibrate in μm e non in pixel.
    2. Misura l'altezza di BLamD nelle immagini. Fare clic sull'icona Diritto nella barra delle applicazioni Fiji ImageJ. Fare clic e trascinare una linea dalla lamina elastica di BrM alla parte superiore del deposito più alto nell'immagine (Figura supplementare 8). Fare clic su Analizza > misura nella barra dei menu Fiji ImageJ per ottenere l'altezza BLamD nell'immagine.
      NOTA: Se non ci sono BLamD nell'immagine, tracciare una linea dalla lamina elastica di BrM alla lamina basale dell'RPE.
    3. Trasferisci le altezze BLamD su un foglio di calcolo ed etichetta con identificazione del mouse.
  17. Calcola le frequenze cumulative delle altezze BLamD per genotipo e le medie delle altezze BLamD per mouse nel foglio di calcolo. Eseguire analisi statistiche sulle medie delle altezze BLamD per determinare se ci sono differenze significative tra i gruppi nello studio.

3. Valutazione dell'RPE del topo mediante microscopia confocale

  1. Raccogli gli occhi dai topi. Eutanasia dei topi secondo la procedura descritta al punto 1.3. Enucleare gli occhi usando il punto 1.5. Posizionare gli occhi usando una pinza curva in un microtubo da 2 ml con 2 ml di 1x PBS e identificazione del mouse.
    NOTA: Non adattare al buio i topi, poiché l'interdigitalizzazione dei fotorecettori e dei processi apicali RPE consente una migliore visualizzazione dell'RPE attraverso la microscopia confocale.
  2. Pulire e sezionare immediatamente gli occhi del topo per generare oculari posteriori del topo.
    NOTA: La coppa oculare posteriore è diversa dal segmento posteriore perché non contiene la retina neurale.
    1. Trasferire l'occhio su una capsula di Petri contenente 1x PBS al microscopio da dissezione (Figura supplementare 9A).
    2. Rimuovere il grasso e il muscolo dal bulbo oculare, come descritto al punto 1.8.2 (Figura supplementare 9B).
    3. Nick la cornea del bulbo oculare con una lama di bisturi numero 11. Rimuovere la cornea e l'iride, come descritto al punto 1.8.3 (Figura supplementare 9C).
    4. Estrarre l'obiettivo con una pinza a punta fine. Prendi due pinze a punta fine e separa delicatamente la retina neurale dal segmento posteriore.
    5. Tagliare con cura la retina neurale alla testa del nervo ottico per la rimozione dalla coppa oculare posteriore (Figura supplementare 9D).
    6. Posizionare la coppa oculare posteriore in un nuovo microtubo da 2 mL contenente 500 μL di 1x PBS con identificazione del mouse.
  3. Fissare le conchiglie oculari posteriori con metanolo (MeOH) (Figura supplementare 10).
    NOTA: il passaggio 3.3 richiede circa 2 ore e 40 minuti per essere completato.
    1. Aggiungere 500 μL di MeOH ai tessuti. Incubare su uno shaker a 75 giri / min per 5 minuti a RT.
    2. Rimuovere i 500 μL di soluzione dai tessuti e aggiungere 500 μL di MeOH. Incubare per 5 minuti su uno shaker a 75 giri / min per 5 minuti su RT. Ripetere questo passaggio ancora una volta.
    3. Rimuovere l'intera soluzione dai tessuti e aggiungere 500 μL di MeOH. Incubare su uno shaker a 75 rpm per almeno 2 h a RT.
      NOTA: In alternativa al punto 3.3.3, la coppa oculare posteriore può essere incubata durante la notte in MeOH su uno shaker a 75 giri/min in una stanza a 4 °C.
    4. Aggiungere 500 μL di 1x PBS ai tessuti. Incubare su uno shaker a 75 giri / min per 5 minuti a RT.
    5. Rimuovere i 500 μL di soluzione dai tessuti e aggiungere 500 μL di 1x PBS. Incubare su uno shaker a 75 giri / min per 5 minuti a RT. Ripetere questo passaggio ancora una volta.
    6. Rimuovere l'intera soluzione dai tessuti e sostituirla con 500 μL di 1x PBS.
      NOTA: I tessuti sono completamente fissati dal MeOH e possono essere conservati in frigorifero a 4 °C per almeno 1 mese.
  4. Eseguire la colorazione con immunofluorescenza delle conchiglie oculari posteriori per visualizzare giunzioni e nuclei stretti dell'RPE (Figura supplementare 11).
    1. Rimuovere i 500 μL di 1x PBS dai campioni e aggiungere 100 μL di siero d'asina normale diluito al 10% in 1x soluzione di PBS. Incubare su uno shaker a 75 giri / min per 30 minuti a RT.
    2. Rimuovere la soluzione diluita di siero d'asino normale al 10% dai campioni e aggiungere 100 μL di una diluizione 1:50 di un anticorpo policlonale anti-Zonula Occludens-1 (ZO-1) di coniglio in 1x PBS. Trasferire i campioni in una stanza a 4 °C e incubare per una notte su uno shaker a 75 giri/min.
    3. Rimuovere la diluizione anticorpale dai campioni e aggiungere 2 ml di 1x PBS. Incubare su uno shaker a 75 rpm per 10 minuti a RT. Ripetere questo passaggio altre due volte.
    4. Rimuovere 1x PBS dai campioni. Aggiungere 100 μL di una diluizione 1:250 di un anticorpo IgG anti-coniglio d'asino con un tag coniugato con fluorofori 488 e una diluizione 1:250 di 4',6-diamidina-2'-fenilindolo dicloridrato (DAPI) in 1x PBS ai campioni. Coprire i campioni con un foglio di alluminio e incubare su uno shaker a 75 giri / min per 2 ore a RT.
      NOTA: I campioni devono essere completamente coperti con un foglio di alluminio per evitare il fotosbiancamento.
    5. Rimuovere l'anticorpo e le diluizioni DAPI dai campioni. Aggiungere 2 ml di 1x PBS ai campioni, ricoprire con un foglio di alluminio e incubare su uno shaker a 75 rpm per 10 minuti a RT. Ripetere questo passaggio altre tre volte.
      NOTA: Le giunzioni strette e i nuclei dell'RPE sono ora completamente etichettati e colorati, rispettivamente.
  5. Montare le conchiglie oculari posteriori su vetrini da microscopio.
    1. Etichettare un vetrino da microscopio con l'identificazione del mouse. Trasferire la coppa oculare posteriore su un vetrino da microscopio sotto un microscopio da dissezione con il lato coroideale rivolto verso il basso. Aggiungere una goccia di 1x PBS all'oculare posteriore per evitare che si secchi (Figura supplementare 12).
    2. Tagliare la coppa oculare posteriore usando una lama di bisturi numero 11 in quattro punti che produrranno quattro quadranti corrispondenti alle direzioni cardinali (cioè nord, est, sud e ovest). Dab eccesso 1x PBS con tessuto dal perimetro della coppa oculare posteriore. Appiattire delicatamente la concia oculare posteriore con una spazzola per capelli di cammello e una pinza a punta fine (Figura supplementare 12).
      NOTA: il prodotto risultante è ora noto come montaggio piatto RPE.
    3. Aggiungere una goccia di supporto di montaggio al supporto piatto RPE e posizionare una copertina sopra di esso. Applicare lo smalto trasparente per sigillare il coprivetrino e lasciarlo asciugare per almeno 30 minuti a RT in un cassetto chiuso. Collocare i vetrini in una scatola portavetrini e conservare la scatola in frigorifero a 4 °C.
      NOTA: fare attenzione a evitare l'introduzione di bolle sul supporto piatto RPE. I supporti piatti RPE possono essere ripresi entro un periodo di tempo di 2 settimane.
  6. Ottenere un'immagine di ciascuno dei quattro quadranti che circondano il nervo ottico della montatura piatta RPE su un microscopio confocale con ingrandimento 20x per ciascun campione. Un esempio di immagine a montaggio piatto RPE può essere trovato nella Figura supplementare 13A.
    NOTA: potrebbe essere necessario eseguire l'imaging z-stack dei supporti piatti RPE in cui vengono scattate e impilate più immagini per compensare le differenze dimensionali del montaggio piatto RPE.
  7. Tracciare le giunzioni strette delle celle RPE all'interno di ciascuna immagine a montaggio piatto RPE. Un esempio di immagine a montaggio piatto RPE tracciata è disponibile nella Figura supplementare 13B.
    1. Aprire il programma Fiji ImageJ. Trascinare un'immagine con montaggio piatto RPE nella barra delle applicazioni Fiji ImageJ. Verifica che l'immagine sia calibrata in micrometri e non in pixel.
    2. Fare doppio clic sull'icona dello strumento Pennello sovrapposto nella barra delle applicazioni Fiji ImageJ per impostare la larghezza del pennello su 3, la trasparenza su 0 e il colore su rosso. Fate clic sul pulsante Chiudi nella finestra dello strumento pennello sovrapposto .
    3. Fare clic sull'icona dello strumento Pennello sovrapposizione . Fare clic e trascinare sulle giunzioni strette di tutte le celle RPE che si trovano completamente all'interno dell'immagine.
      NOTA: nel caso in cui venga commesso un errore di ricalco, fare doppio clic sull'icona dello strumento Pennello sovrapposto e fare clic sulla casella Annulla nella finestra dello strumento Pennello sovrapposizione per rimuovere l'errore di ricalco dall'immagine.
    4. Fare clic sull'icona Rettangolo nella barra delle applicazioni Fiji ImageJ. Fai clic sull'immagine e trascina lungo il perimetro dell'immagine. Fare clic su Modifica > Cancella sulla barra dei menu Fiji ImageJ per mantenere le linee tracciate e rimuovere eventuali colori blu e verde dall'immagine.
    5. Salvare l'immagine di traccia in una posizione appropriata con l'identificazione del mouse, la posizione del quadrante (ad esempio, nord, sud, est o ovest) e un'etichetta del suffisso CP.
      NOTA: non salvare l'immagine di traccia RPE prima di aver completato il passaggio 3.7.4.
  8. Calcolare le aree delle celle RPE per ciascun campione.
    1. Designare un percorso in cui salvare i file dall'analisi dell'area RPE creando una cartella sullo schermo del desktop del computer. Generare sottocartelle per ogni immagine di traccia RPE ed etichettare le sottocartelle con l'identificazione del mouse e la posizione del quadrante (ad esempio, nord, sud, est o ovest).
    2. Installare e aprire il programma Cell Profiler29. Scaricare il file di progetto Ikeda_RPE Area Calculator.cpproj (Supplementary Coding File 1). Aprire il file Ikeda_RPE Area Calculator.cpproj facendo clic su File > Apri progetto nella barra dei menu del programma Cell Profiler.
    3. Trascinare un'immagine di traccia RPE nella casella Immagine > Trascina qui file e cartelle nella finestra del programma Cell Profiler.
    4. Immettere il percorso della cartella nel programma Cell Profiler corrispondente all'immagine di traccia RPE. Fare clic sul pulsante Impostazioni di output nell'angolo in basso a sinistra della finestra del programma Cell Profiler e immettere la posizione della cartella nelle caselle di testo Cartella di input predefinita e Cartella di output predefinita.
    5. Fare clic sul pulsante Analizza immagini nell'angolo in basso a sinistra della finestra del programma Cell Profiler. Al termine dell'analisi, sullo schermo verrà visualizzata una finestra Analisi completata . Fare clic sul pulsante OK nella finestra Analisi completata .
      NOTA: questa azione genererà un file csv e un'immagine jpeg. Il file csv conterrà le aree per le celle RPE all'interno dell'immagine di traccia. L'immagine jpeg corrisponderà all'immagine di traccia RPE, in cui ogni cella RPE sarà etichettata con un numero (Figura supplementare 13C).
    6. Trasferire le aree RPE dal file CSV a un foglio di calcolo. Etichetta il foglio di calcolo con l'identificazione del mouse.
    7. Eseguire un'indagine di controllo qualità dei dati confermando che ogni area RPE nel file CSV si collega a una cella RPE completamente tracciata in un'immagine jpeg. Rimuovere dal foglio di calcolo eventuali valori che non corrispondono a celle RPE completamente tracciate.
    8. Tornare al programma Cell Profiler. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul nome dell'immagine di traccia RPE nella casella Trascina qui file e cartelle e selezionare Cancella l'elenco per rimuovere l'immagine dal programma Cell Profiler.
    9. Ripetere i passaggi 3.8.3-3.8.8 per calcolare le dimensioni RPE per le restanti tre immagini di traccia RPE del campione.
  9. Quantificare le medie delle dimensioni delle celle RPE per ogni campione nel foglio di calcolo.
  10. Quantificare le densità delle celle RPE per ogni campione nel foglio di calcolo. Per calcolare la densità delle celle RPE, dividere il numero totale di celle RPE per quadrante per l'area totale di celle RPE per quadrante rilevata dal programma Cell Profiler. Determinare la media delle densità delle celle RPE dai quattro quadranti per campione.
  11. Quantificare il numero di celle RPE multinucleate per montaggio piatto RPE per ciascun campione. Utilizzare l'applicazione Cell Counter all'interno del programma Fiji ImageJ, come descritto nei passaggi 1.15.1-1.15.3, per contare il numero di celle RPE con più di tre nuclei in quattro quadranti del campione.
  12. Eseguire analisi statistiche sulle dimensioni delle cellule RPE e sulle medie di densità, nonché sul numero di cellule RPE multinucleate per determinare se ci sono differenze significative tra i gruppi nello studio.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Il completamento del protocollo di fenotipizzazione RPE descritto in questo articolo fornisce un'analisi quantitativa delle anomalie strutturali di RPE comunemente osservate nei modelli murini di AMD. Per confermare l'efficacia di questo protocollo, lo abbiamo usato in topi noti per mostrare patologie RPE, inclusi topi transgenici che sovraesprimono WT Tmem135 guidato dal promotore della beta-actina di pollo (Tmem135 TG) 30 e topi C57BL / 6J invecchiati 31,32. L'obiettivo di questi esperimenti è quello di mostrare risultati rappresentativi che potrebbero essere ottenuti utilizzando i metodi descritti in questo protocollo ai ricercatori nuovi ai modelli murini.

Abbiamo aderito ai metodi nella fase 1 del protocollo per elaborare e valutare gli occhi di topi WT e Tmem135 TG per valutare le patologie RPE utilizzando la microscopia ottica. Abbiamo scoperto che i topi Tmem135 TG di 4 mesi hanno una significativa riduzione dello spessore RPE a due intervalli misurati rispetto al WT di età corrispondente attraverso un ANOVA con test Tukey post-hoc (Figura 4). Questi risultati indicano che l'RPE è più sottile nei topi Tmem135 TG di 4 mesi rispetto ai topi WT di età corrispondente a 600 e 900 μm di distanza dal nervo ottico.

Inoltre, utilizzando i metodi della fase 1 del protocollo, abbiamo calcolato l'incidenza delle patologie RPE, tra cui microvacuolizzazione, macrovacuolizzazione e migrazione di tre topi WT e Tmem135 TG di 25 giorni (Figura 5A). La frequenza media delle patologie di microvacuolizzazione RPE per vetrino nei topi WT era 0,67 ± 0,31 e nei topi Tmem135 TG era 7,07 ± 0,61 (Figura 5B). Non c'è stata macrovacuolizzazione RPE nei topi WT, ma ci sono stati, in media, 5,33 ± 2,02 eventi di macrovacuolizzazione nei topi Tmem135 TG (Figura 5C). Infine, i tassi di cellule RPE migratorie per vetrino erano pari a zero nei topi WT e 0,4 ± 0,35 nei topi TG Tmem135 (Figura 5D). Dopo aver eseguito il test t di uno studente, l'incidenza della microvacuolizzazione e della microvacuolizzazione RPE era significativamente diversa tra i topi WT e Tmem135 TG. Tuttavia, la maggiore incidenza di cellule migratorie RPE nei topi Tmem135 TG non era significativamente diversa rispetto a WT (p = 0,1161). Questi dati mostrano che la microvacuolizzazione e la macrovacuolizzazione RPE, ma non la migrazione, sono significativamente più alte nei topi Tmem135 TG di 25 giorni rispetto ai topi WT.

Seguendo i metodi del protocollo incluso nella fase 2, abbiamo preparato sezioni retiniche da topi WT C57BL / 6J di 2 mesi e 24 mesi per la microscopia elettronica a trasmissione per analizzare la presenza e le altezze di BLamDs. Abbiamo trovato BLamD presenti nelle retine WT di 24 mesi che erano notevolmente assenti nelle retine WT di 2 mesi (Figura 6A). Abbiamo presentato le altezze dei BLamD nelle retine WT di 24 mesi calcolando e tracciando le frequenze cumulative della loro comparsa. Le frequenze cumulative delle altezze BLamD sono state rappresentate graficamente rispetto all'altezza del deposito per illustrare la distribuzione delle altezze di deposito. C'è uno spostamento a destra della linea per le altezze WT BLamD di 24 mesi rispetto alle altezze WT BLamD di 2 mesi, dimostrando un aumento dei depositi nei topi WT di 24 mesi (Figura 6B). Questo grafico è supportato da una media più ampia di altezze BLamD nelle retine WT di 24 mesi (1,01 μm ± 0,43 μm) rispetto alle retine WT di 2 mesi (0,23 μm ± 0,017 μm), che erano significativamente diverse dal test t di uno studente (Figura 6C). In sintesi, concludiamo che i topi WT di 24 mesi hanno grandi BLamD nello spazio sub-RPE delle loro retine rispetto ai topi WT di 2 mesi.

Abbiamo applicato i metodi di preparazione degli occhi da topi WT e Tmem135 TG di 4 mesi nella fase 3 per generare supporti piatti RPE per il rilevamento e l'analisi della dismorfia RPE e della multinucleazione. In questo protocollo, abbiamo definito la dismorfia RPE dai cambiamenti nelle dimensioni e nella densità delle cellule RPE in un modello di mouse AMD rispetto ai loro controlli. Abbiamo scoperto che l'RPE nei topi TG Tmem135 di 4 mesi sono dismorfici (Figura 7A). L'RPE nelle retine TG Tmem135 è più grande (806,89 μm 2 ± 252,67 vs 291,69 μm 2 ± 26,31) e meno denso (0,0014 cellule/μm 2 ± 0,00039 vs. 0,0033 cellule/μm 2 ± 0,00024) rispetto alle retine WT di pari età (Figura 7B,C). Inoltre, c'erano più cellule RPE multinucleate nelle retine TG Tmem135 rispetto ai controlli WT (8,04 cellule ± 5,54 vs 0,33 cellule ± 0,29) (Figura 7D). Tutti questi parametri hanno raggiunto la significatività statistica con il test t di uno studente. Insieme, i topi TG Tmem135 di 4 mesi hanno più cellule RPE dismorfiche e multinucleate rispetto ai topi WT di 4 mesi.

Figure 1
Figura 1: Patologie RPE rilevate al microscopio ottico. Immagini rappresentative di RPE normale in WT (A) e RPE anomalo in topi TG Tmem135 (B-E). Le patologie RPE osservate nei topi Tmem135 TG includono assottigliamento RPE (B), macrovacuolizzazione (C), microvacuolizzazione (D) e migrazione (E). Ogni patologia è illustrata da una freccia nera. Barra della scala = 100 μm. Ingrandimento = 20x. Abbreviazioni: RGC = strato di cellule gangliari retiniche, IPL = strato plessiforme interno, INL = strato nucleare interno, OPL = strato plessiforme esterno, ONL = strato nucleare esterno, IS = segmenti interni dei fotorecettori, OS = segmenti esterni dei fotorecettori, RPE = epitelio pigmentato retinico, Cho = coroide. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Patologie RPE rilevate mediante microscopia elettronica a trasmissione. Immagini rappresentative di (A) RPE in giovani topi CFH-H/H e (B) CFH-H/H di 2 anni che presentano abbondanti depositi laminari basali (BLamD). I BLamD sono tracciati con punti gialli nell'immagine. Barra di scala = 800 nm. Ingrandimento = 15.000x. Abbreviazioni: N = nucleo, M = mitocondrio, P = granulo di pigmento, BI = ripiegamenti basali, EL = lamina elastica, RPE = epitelio pigmentato retinico, BrM = membrana di Bruch, Cho = coroide. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Patologie RPE rilevate al microscopio confocale. Immagini rappresentative di (A) RPE normale di WT di 8 mesi e (B) RPE anormale di topi TG Tmem135 di 8 mesi che presentano dismorfia RPE. Il quadrato bianco viene ingrandito (C) per rappresentare una cella RPE multinucleata con tre nuclei. Il colore verde è anti-ZO1 associato alle giunzioni strette RPE e il colore blu è la colorazione DAPI dei nuclei RPE. Barra di scala = 50 μm. Ingrandimento = 20x. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Spessore RPE in topi wild-type (WT) e Tmem135 TG di 4 mesi. (A) Immagini rappresentative della retina di topi WT e Tmem135 TG (TG) di 4 mesi. Ingrandimento = 20x. Barra di scala = 100 μm. (B) Grafici a linee delle misure dello spessore RPE in topi WT (nero) e Tmem135 TG di 4 mesi (verde) fino a 3.000 μm di distanza dal nervo ottico. I numeri dopo il genotipo indicano il numero di topi utilizzati in questo studio. *p < 0.05, ANOVA con test Tukey post-hoc. Tutti i dati sono medi ± sd. Si veda la legenda della Figura 1 per le abbreviazioni degli strati retinici. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Patologie RPE in topi Tmem135 TG di 25 giorni. (A) Immagini rappresentative di microvacuolizzazione, macrovacuolizzazione e migrazione RPE in tre topi Tmem135 TG (TG) di 25 giorni. Le patologie RPE sono evidenziate da frecce nere in ogni immagine. Ingrandimento = 40x. Barra di scala = 20 μm. (B-D) Quantificazione della micro- e macrovacuolizzazione di RPE e di cellule RPE migratorie in topi WT e Tmem135 TG di 25 giorni. I numeri tra parentesi indicano il numero di topi utilizzati in questo studio. *p < 0.05 e ****p < 0.0001, test t dello studente. Tutti i dati sono ± sd. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Analisi ultrastrutturale di BLamD in retine WT giovani e invecchiate . (A) Micrografie elettroniche rappresentative di WT RPE di 2 mesi e 24 mesi. Ingrandimento = 15.000x. Barra di scala = 800 nm. Un esempio di deposito laminare basale (BLamD) è rappresentato con una parentesi. (B) Frequenze cumulative delle altezze BLamD. (C) Media dell'altezza BLamD. I numeri tra parentesi indicano il numero totale di topi per genotipo utilizzato in questo studio. **P < 0.01, test t dello studente. Tutti i dati sono medi ± sd. Vedere la legenda della Figura 2 per le abbreviazioni degli strati retinici. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 7
Figura 7: I supporti piatti RPE rivelano patologie RPE nei topi Tmem135 TG. (A) Immagini rappresentative di supporti piatti RPE WT e Tmem135 TG (TG) di 4 mesi con anti-ZO-1 in verde e DAPI in blu. Ingrandimento = 20x. Barra di scala = 100 μm. (B) dimensione della cella RPE, (C) densità delle cellule RPE e (D) multinucleazione RPE in topi WT e Tmem135 TG di 4 mesi. Il numero tra parentesi indica il numero di topi utilizzati nello studio. *p < 0.05, **p < 0.01 e ****p < 0.0001, test t dello studente. Tutti i dati sono ± sd. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura supplementare 1: Schema della configurazione e dell'uso della perfusione cardiaca. (A) Sistema di perfusione gravitazionale. (B) Cilindro della siringa del sistema di perfusione per tampone fissativo. (C) La valvola deve essere ruotata fino a quando non è parallela alla tubazione per consentire al tampone di fluire attraverso la tubazione. (D) Valvola da ruotare fino a quando non è perpendicolare alla tubazione per impedire al tampone di fluire nella tubazione. Immagine creata in Biorender. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2: Schema della procedura per la perfusione cardiaca di un topo. (A) Quattro incisioni fatte per esporre la cavità addominale. (B) Taglio fatto attraverso il diaframma e lo sterno per esporre il cuore. (C) Ago di misura inserito nel ventricolo sinistro del cuore. La valvola viene ruotata fino a quando non è parallela alla linea del tubo. L'atrio destro viene tagliato con forbici curve per consentire al sangue e al fissativo di uscire. Immagine creata in Biorender. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 3: Schema della procedura per enucleare gli occhi da un topo. (A) Spingere delicatamente verso il basso con il pollice e l'indice intorno all'orbita oculare per causare la sporgenza dell'occhio dall'orbita oculare. (B) Prendere le forbici curve e tenerle con la lama ad un angolo di 30° rispetto all'orbita oculare. Procedere al taglio intorno all'occhio con le forbici curve con un angolo di 30°. I punti colorati rappresentano il posizionamento delle dita sul mouse o le forbici curve. Immagine creata in Biorender. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 4: Immagini della dissezione dell'occhio del topo per ottenere il segmento posteriore del topo. (A) Occhio trasferito su un microscopio da dissezione. (B) Grasso e muscoli rimossi dal bulbo oculare. (C) Cornea e iride rimosse dal bulbo oculare. (D) Lente rimossa dal bulbo oculare. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 5: Procedura di colorazione dell'eosina (H&E). Schema raffigurante la procedura H&E per colorare sezioni retiniche incorporate in paraffina. Le frecce indicano il trasferimento tra i passaggi. L'ora di ogni passaggio è indicata in carattere rosso. I reagenti per la colorazione sono forniti in caratteri neri all'interno di contenitori di colorazione di vetro. Ci dovrebbe essere un contenitore di colorazione di vetro preparato per ciascun reagente incluso nello schema sopra. Tutti i passaggi devono essere completati in una cappa aspirante. Quando aggiungi una vetrina a una diapositiva, fai attenzione a non introdurre bolle nella diapositiva. Dopo il completamento della procedura, le diapositive possono essere memorizzate in una casella di diapositive. Immagine creata in Biorender. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 6: Esempio di misurazione dello spessore RPE. La freccia nera raffigura una linea rossa dall'alto verso il basso dell'RPE. Questa linea può essere misurata per determinare lo spessore dell'RPE. Barra della scala = 100 μm. Ingrandimento = 20x. L'area riepilogata viene rimpicciolita per facilitare la visualizzazione dell'RPE. Si veda la legenda della Figura 1 per le abbreviazioni degli strati retinici. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 7: Procedura di disidratazione EtOH di segmenti posteriori di topo per l'elaborazione TEM. Immagine creata in Biorender. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 8: Esempio di misurazione dell'altezza BLamD. La linea rossa raffigura il BLamD più grande in questa immagine. I punti gialli delineano i BLamD nell'immagine. Questa linea rossa può essere misurata per determinare l'altezza di questo BLamD in questa immagine. Barra di scala = 800 nm. Ingrandimento = 15.000x. Vedere la legenda della Figura 2 per le abbreviazioni degli strati retinici. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 9 supplementare: Dissezione dell'occhio del mouse per montaggio piatto RPE. (A) Occhio trasferito in una capsula di Petri contenente 1x PBS al microscopio da dissezione. (B) Grasso e muscoli rimossi dal bulbo oculare. (C) Cornea e iride rimosse dal bulbo oculare. (D) Lente e retina rimosse dal bulbo oculare. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 10: Procedura di fissazione del metanolo (MeOH) delle conchiglie oculari posteriori del topo. Immagine creata in Biorender. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 11: Procedura di immunofluorescenza per marcare giunzioni strette e nuclei di cellule RPE. Diagramma raffigurante le fasi della tecnica di immunofluorescenza da questo protocollo. Nota che questa tecnica richiede 2 giorni per essere completata. Tutti i passaggi avvengono a RT e su uno shaker con una velocità di 75 giri / min, se non diversamente specificato nel diagramma. L'anticorpo primario (1°) utilizzato in questo studio era l'anti-ZO1 policlonale di coniglio e l'anticorpo secondario (2º) utilizzato in questo studio era 488 IgG anti-coniglio coniugate con fluorofori. Una volta che l'anticorpo secondario e DAPI vengono aggiunti ai campioni, i campioni devono essere avvolti in un foglio di alluminio per proteggere dal fotosbiancamento del campione. Immagine creata in Biorender. Abbreviazioni: NDS = siero normale dell'asino, Ab = anticorpo. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 12: Rappresentazione dei tagli per produrre quattro quadranti del supporto piatto RPE del mouse. N = nord, E = est, S = sud, W = ovest. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 13: Esempi di endpoint di analisi RPE flat mount . (A) Immagine a montaggio piatto RPE. (B) Immagine di traccia del limite RPE. (C) RPE Cell Profiler ha analizzato l'immagine. Ingrandimento = 20x. Clicca qui per scaricare questo file.

Codifica supplementare File 1: Ikeda RPE Area Calculator.cpproj Clicca qui per scaricare questo file.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In questo articolo, abbiamo introdotto un protocollo di fenotipizzazione per valutare le patologie RPE strutturali dei modelli murini. Abbiamo descritto i passaggi necessari per l'elaborazione degli occhi per varie tecniche di imaging tra cui luce, elettrone di trasmissione e microscopia confocale, nonché la quantificazione delle patologie tipiche osservate tramite questi metodi di imaging. Abbiamo dimostrato l'efficacia del nostro protocollo di fenotipizzazione RPE esaminando Tmem135 TG e topi WT di 24 mesi, poiché questi topi mostrano patologie RPE30,31,32. Questo protocollo può essere applicato a qualsiasi topo geneticamente modificato o trattato farmacologicamente che può ospitare patologie RPE come assottigliamento RPE, vacuolizzazione, migrazione e dismorfia, così come BLamDs 6,7. Sebbene le patologie RPE osservate nei topi Tmem135 TG e WT di 24 mesi siano presenti in altri modelli di topo AMD 7,30, è importante che il ricercatore acquisisca familiarità con il modello murino AMD scelto per i loro studi, poiché l'età di insorgenza e la gravità delle patologie RPE del loro modello murino AMD possono differire dal modello murino Tmem135 TG e topi WT di 24 mesi. I ricercatori potrebbero aver bisogno di utilizzare più topi per i loro studi rispetto al numero di topi utilizzati per produrre i risultati rappresentativi mostrati in questo articolo, se la presentazione delle patologie RPE è variabile nel rispettivo modello murino AMD. Inoltre, molti modelli di mouse AMD sono attualmente disponibili per i ricercatori AMD, ma non hanno descrizioni complete delle loro patologie RPE, che potrebbero richiedere ai ricercatori di eseguire studi preliminari per acquisire queste informazioni.

Sebbene sia possibile apportare modifiche al modo in cui gli occhi del topo vengono elaborati per i vari metodi di imaging, è fondamentale mantenere la valutazione quantitativa delle anomalie strutturali dell'RPE come descritto nel protocollo. Ad esempio, sono state preparate cinque sezioni retiniche colorate con H & E per contare il numero di eventi di microvacuolizzazione, macrovacuolizzazione e migrazione RPE, consentendo ai ricercatori di valutare le patologie RPE in più posizioni nella retina del topo. Un altro esempio è l'utilizzo di una griglia di microscopia elettronica in rame a barra sottile a 400 maglie per valutare le anomalie ultrastrutturali dell'RPE. La griglia di microscopia elettronica fornisce un quadro per valutare un campione retinico in modo sistematico e imparziale mediante micrografia elettronica a trasmissione, nonché ottenere da 40 a 70 immagini per sezione retinica per esaminare la presenza di BLamD. Questo non può essere ottenuto con una griglia di microscopia elettronica e suggeriamo di non utilizzarli con questo protocollo. Infine, l'acquisizione di immagini con ingrandimento 20x dai quattro quadranti di un montaggio piatto RPE consente ai ricercatori di studiare ampie aree di RPE murino per la dismorfia e la multinucleazione. I ricercatori sono liberi di espandere questo protocollo ed esaminare ulteriori sezioni retiniche per le patologie RPE nei loro studi. Insieme, questi metodi consentono ai ricercatori di raccogliere ampi dati per trarre conclusioni sulle patologie RPE strutturali che possono essere presenti nei loro modelli murini AMD.

Un'altra caratteristica chiave di questo protocollo è la coerenza dei metodi di fenotipizzazione RPE. Ad esempio, tutti gli occhi utilizzati per la microscopia elettronica a luce e trasmissione erano orientati dal lato superiore della retina del topo per il sezionamento. È importante mantenere l'orientamento dell'occhio del topo durante tutta la sua elaborazione per la microscopia elettronica a luce e trasmissione perché l'occhio del topo ha una distribuzione topografica delle cellule retiniche33,34. L'orientamento anatomico dell'occhio del mouse non è stato mantenuto per la preparazione del montaggio piatto RPE, poiché non sono stati osservati cambiamenti topografici superiori a inferiori della cella RPE del topo. In effetti, l'RPE nella retina umana mostra cambiamenti topografici che si irradiano lontano dalla testa del nervo ottico35, suggerendo che questo potrebbe essere il caso dell'RPE del topo. Infine, l'acquisizione delle immagini descritta in questo protocollo si basa sul posizionamento anatomico del nervo ottico. L'inclusione di questi aspetti metodologici aiuterà a riprodurre i risultati delle patologie RPE per i ricercatori mentre lavorano con i loro modelli murini AMD.

I ricercatori potrebbero voler aggiungere più caratteristiche analitiche al protocollo di fenotipizzazione RPE. Alcuni esiti fenotipici non presenti in questo protocollo sono l'esame dello spessore BrM, dei microvilli apicali RPE e di altri componenti ultrastrutturali RPE. Questi componenti includono mitocondri, granuli di pigmento e altri organelli come i fagosomi. I ricercatori possono determinare la dimensione e il numero di questi componenti nelle micrografie elettroniche ottenute con questo protocollo utilizzando il programma Fiji ImageJ. In particolare, lo stato dei mitocondri può essere un importante risultato fenotipico da considerare, poiché il targeting dei mitocondri nell'RPE è un'importante strategia terapeutica per AMD36. Un altro risultato fenotipico sono ulteriori misurazioni della dismorfia RPE su supporti piani RPE. Le immagini RPE a montaggio piatto ottenute utilizzando il protocollo possono essere esaminate per la forma esagonale RPE, il numero di celle RPE vicine e altre proprietà con il programma REShAPE (https://github.com/nih-nei/REShAPE)35. Un altro possibile esito fenotipico è se le patologie RPE si verificano nelle aree centrali o periferiche della retina del topo. Queste ulteriori considerazioni fenotipiche rafforzeranno ulteriormente il protocollo di fenotipizzazione RPE descritto in questo articolo.

Ci sono alcune limitazioni di questo protocollo di fenotipizzazione RPE. Una limitazione di questo metodo è la necessità di sacrificare i topi per raccogliere i loro occhi per la fenotipizzazione RPE. In alternativa, i nuovi progressi nell'imaging della tomografia a coerenza ottica del dominio spettrale (SD-OCT) consentono la quantificazione dello spessore e delle patologie RPE nei topi viventi37-39. Questo può essere vantaggioso per i ricercatori che vogliono eseguire studi longitudinali sulle loro coorti di modelli murini AMD. Un'altra limitazione di questo metodo è la mancanza di valutazioni RPE funzionali nei topi. Se i ricercatori sono interessati a una valutazione funzionale dell'RPE nei topi, si consiglia di eseguire l'elettroretinografia e misurare la componente dell'onda c, poiché l'onda c è indicativa del ruolo funzionale dell'RPE nella fototrasduzione40. Un'altra limitazione di questo metodo è la mancanza di misurazioni biochimiche dei marcatori RPE nei topi. Se i ricercatori desiderano studiare i livelli di marcatori RPE, come la proteina legante la retinaldeide cellulare (CRABLP), la proteina 65 kDa specifica per l'epitelio pigmentato retinico (RPE65), la sottofamiglia J membro 13 del canale rettificante interno del potassio (KCNJ13) o la bestrofina 1 (BEST1), raccomandiamo di raccogliere gli occhi per l'immunoistochimica, la PCR quantitativa in tempo reale o l'analisi western blot.

In conclusione, questo protocollo di fenotipizzazione RPE può essere una risorsa importante per i ricercatori che utilizzano modelli murini che ricapitolano gli aspetti patologici dell'AMD. Questo protocollo serve anche a standardizzare il modo in cui l'RPE viene valutato nei modelli di mouse AMD, che non è stato precedentemente descritto in letteratura. La standardizzazione della fenotipizzazione RPE sarebbe fondamentale per tradurre i risultati dai topi ad altri modelli di AMD, compresi i modelli di coltura cellulare RPE4 e modelli di organismi superiori che includono primati non umani. Aiuterebbe anche nella nostra comprensione dei meccanismi patobiologici alla base dello sviluppo di AMD e potenzialmente nello sviluppo di nuove terapie per questa malattia accecante.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori di questo protocollo non hanno divulgazioni e conflitti di interesse.

Acknowledgments

Gli autori desiderano ringraziare Satoshi Kinoshita e il laboratorio TRIP (Translational Research Initiatives in Pathology (TRIP) dell'Università del Wisconsin (UW) per aver preparato i nostri tessuti per la microscopia ottica. Questo nucleo è supportato dal Dipartimento di Patologia e Medicina di Laboratorio della UW, dal Carbone Cancer Center dell'Università del Wisconsin (P30 CA014520) e dall'Ufficio del Direttore-NIH (S10OD023526). La microscopia confocale è stata eseguita presso il nucleo ottico di biochimica UW, che è stato istituito con il supporto del Dipartimento di Biochimica della UW. Questo lavoro è stato sostenuto anche da sovvenzioni del National Eye Institute (R01EY022086 a A. Ikeda; R01EY031748 a C. Bowes Rickman; P30EY016665 al Dipartimento di Oftalmologia e Scienze Visive della UW; P30EY005722 al Duke Eye Center; NIH T32EY027721 a M. Landowski; F32EY032766 a M. Landowski), Presidenza di Timothy William Trout (A. Ikeda), FFB Free Family AMD Award (C. Bowes Rickman); e una sovvenzione illimitata dalla Ricerca per prevenire la cecità (Duke Eye Center).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 M Cacodylate Buffer pH7.2 PolyScientiifc R&D Company S1619
100 Capacity Slide Box Two are needed for this protocol (one for H&E-stained slides and one for RPE flat mounts.)
100% Ethanol  MDS Warehouse 2292-CASE Can be used to make diluted ethanol solutions in this protocol.
1-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks Qosina 11069
1x Phosphate Buffer Solution (PBS) Premade 1x PBS can be used in this protocol. 
2.0 mL microtubes Genesee Scientific  24-283-LR
24 Cavity Embedding Capsule Substitute Mold Electron Microscopy Sciences 70165
24 inch PVC Tubing with Luer Ends Fisher Scientific NC1376778
400 Mesh Gilder Thin Bar Square Mesh Grids Electron Microscopy Sciences T400-Cu
95% Ethanol MDS Warehouse 2293-CASE
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier (23 inches by 24 inches) VWR 56616-031
Adjustable 237 ml  Spray Bottle VWR 23609-182
Alexa Fluor488 Conjugated Donkey anti-Rabbit IgG  Thermo Fisher Scientific A-21206
Aluminum Foil
BD Precision glide 19 Gauge Syringe Needle Sigma-Aldrich  Z192546
Bracken Forceps; Curved; Fine Cross Serrations; 4" Length, 1 mm Tip Width Roboz Surgical Instrument RS-5211 Known as curved forceps in this protocol.
Camel Hair Brush Electron Microscopy Sciences 65575-02
Carbon Dioxide Euthanasia Chamber
Carbon Dioxide Flow Meter
Carbon Dioxide Tank
Castaloy Prong Extension Clamps Fisher Scientific  05-769-7Q
Cast-Iron L-shaped Base Support Stand Fisher Scientific  11-474-207
Cell Prolifer Program Available to download: https://cellprofiler.org/releases
Clear Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180
Colorfrost Microscope Slides Lavender VWR 10118-956
Computer
DAPI Sigma-Aldrich D9542-5MG
Distilled H20 Water from Milli-Q Purification System was used in this protocol.
Dumont Thin Tip Tweezers; Pattern #55 Roboz Surgical Instrument RS-4984 Known as fine-tipped forceps in this protocol, and 3 are needed for this protocol (two for dissections and one for electron microscope processing).
Electron Microscopy Grid Holder Electron Microscopy Sciences 71147-01
EPON 815 Resin Electron Microscopy Sciences 14910
Epredia Mark-It Tissue Marking Yellow Dye Fisher Scientific  22050460 Please follow manufacturer's protocol when using this tissue marking dye. 
Epredia Mounting Media Fisher Scientific 22-110-610 Use for mounting H&E slides. 
Fiber-Lite Mi-150 Illuminator Series,150 w Halogen Light Source Dolan-Jenner Industries Mi-150 Light source for dissecting microscope.
Fiji ImageJ Program Available to download: https://imagej.net/downloads
Flexaframe Castaloy Hook Connector Thermo Scientific   14-666-18Q
Fume hood
Glutaraldehyde 2.5% in Phosphate Buffer, pH 7.4, 32% Electron Microscopy Sciences 16537-05
JEM-1400 Transmission Electron Microscope (JEOL) with an ORIUS (1000) CCD Camera
Laboratory Benchtop Shaker Two are needed for these experiments. One should be at room temperature while the other should be in a 4 degree Celsius cold room.
Laser Cryo Tag Labels Electron Microscopy Sciences 77564-05
Lead Citrate Electron Microscopy Sciences 17800
Leica EM UC7Ultramicrotome
Leica Reichert Ultracut S Microtome
LifterSlips Thermo Fisher Scientific 22X22I24788001LS Use these coverslips for the RPE flat mounts as they have raised edges and accommodate the thickness of the RPE.
Mayer's Hematoxylin VWR 100504-406
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors Roboz Surgical Instrument RS-5600 Known as micro-dissecting scissors in protocol. 
Methanol Fisher Scientific  A412-4
Mice Any AMD mouse model and its respective controls can work for this protocol.
Micro Dissecting Scissors; Standard Version; Curved; Sharp Points; 24 mm Blade Length; 4.5" Overall Length Roboz Surgical Instrument RS-5913 Known as curved scissors in this protocol.
Microsoft Excel
Microtube racks
Nikon A1RS Confocal Microscope
Normal Donkey Serum SouthernBiotech 0030-01
Number 11 Sterile Disposable Scalpel Blades VWR 21909-380
Osmium Tetroxide  Electron Microscopy Sciences 19150
Paraformaldehyde, 32% Electron Microscopy Sciences 15714-S
Pencil
Petri Dish VWR  21909-380
Pipette Tips
Pipettes 
Polyclonal Anti-ZO-1 Antibody Thermo Fisher Scientific 402200
Propylene Oxide Electron Microscopy Sciences 20412
Razor Blade VWR 10040-386
Shallow Tray for Mouse Perfusions
Shandon Eosin Y Alcoholic VWR 89370-828
Sharpie Ultra Fine Tip Black Permanent Marker Staples 642736
Slide Rack for Staining Grainger 49WF31
Squared Cover Glass Slips Fisher Scientific  12-541B
Staining Dish with Cover Grainger 49WF30 Need 15 for H&E staining procedure.
Target All-Plastic Disposable Luer-Slip 50 mL Syringe  Thermo Scientific  S7510-50 Use only the syringe barrel.
Timer Fisher 1464917
Uranyl Acetate Electron Microscopy Sciences 22400
Vacuum Oven
Vectashield Mounting Medium Vector Laboratories H-1000 Use for mounting RPE flat mounts. 
Xylene Fisher Scientific  22050283
Zeiss Axio Imager 2 Light Microscope This microscope has the capacity to generate stitched 20x images. If a light microscope does not have this capacity, then take images of the entire retina that are slightly overlapping each other. Use Adobe Photoshop to stitch these images together. Please refer to the manuals of the Adobe Photoshop program for image stitching. 
Zeiss Stemi 2000 Dissecting Microscope Electron Microscopy Sciences 65575-02

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet. Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).
  2. Bhutto, I., Lutty, G. Understanding age-related macular degeneration (AMD): relationships between the photoreceptor/retinal pigment epithelium/Bruch's membrane/choriocapillaris complex. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 295-317 (2012).
  3. Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progess in Retinal and Eye Research. 100846, (2020).
  4. Bharti, K., et al. Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 222, 109170 (2022).
  5. Forest, D. L., Johnson, L. V., Clegg, D. O. Cellular models and therapies for age-related macular degeneration. Disease Models & Mechanisms. 8 (5), 421-427 (2015).
  6. Landowski, M., Bowes Rickman, C. Targeting lipid metabolism for the treatment of age-related macular degeneration: Insights from preclinical mouse models. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 38 (1), 3-32 (2022).
  7. Pennesi, M. E., Neuringer, M., Courtney, R. J. Animal models of age related macular degeneration. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 487-509 (2012).
  8. Malek, G., Busik, J., Grant, M. B., Choudhary, M. Models of retinal diseases and their applicability in drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 13 (4), 359-377 (2018).
  9. Cao, D., et al. Hyperreflective foci, optical coherence tomography progression indicators in age-related macular degeneration, include transdifferentiated retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 62 (10), 34 (2021).
  10. Ding, J. D., et al. Expression of human complement factor H prevents age-related macular degeneration-like retina damage and kidney abnormalities in aged Cfh knockout mice. The American Journal of Pathology. 185 (1), 29-42 (2015).
  11. Zanzottera, E. C., et al. The project MACULA retinal pigment epithelium grading system for histology and optical coherence tomography in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 56 (5), 3253-3268 (2015).
  12. Ding, J. D., et al. Anti-amyloid therapy protects against retinal pigmented epithelium damage and vision loss in a model of age-related macular degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (28), 279-287 (2011).
  13. Zhang, Q., et al. Comparison of histologic findings in age-related macular degeneration with RPE flatmount images. Molecular Vision. 25, 70-78 (2019).
  14. vonder Emde, L., et al. Histologic cell shape descriptors for the retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: A comparison to unaffected eyes. Translational Vision Science & Technology. 11 (8), 19 (2022).
  15. Gambril, J. A., et al. Quantifying retinal pigment epithelium dysmorphia and loss of histologic autofluorescence in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 60 (7), 2481-2493 (2019).
  16. Bird, A. C., Phillips, R. L., Hageman, G. S. Geographic atrophy: a histopathological assessment. JAMA Ophthalmology. 132 (3), 338-345 (2014).
  17. Zanzottera, E. C., et al. Visualizing retinal pigment epithelium phenotypes in the transition to geographic atrophy in age-related macular degeneration. Retina. 36, 12-25 (2016).
  18. Sura, A. A., et al. Measuring the contributions of basal laminar deposit and Bruch's membrane in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 61 (13), 19 (2020).
  19. Curcio, C. A. Soft drusen in age-related macular degeneration: biology and targeting via the oil spill strategies. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 59 (4), 160 (2018).
  20. Johnson, M., et al. Comparison of morphology of human macular and peripheral Bruch's membrane in older eyes. Current Eye Research. 32 (9), 791-799 (2007).
  21. Sarks, S. H., Arnold, J. J., Killingsworth, M. C., Sarks, J. P. Early drusen formation in the normal and aging eye and their relation to age related maculopathy: a clinicopathological study. The British Journal of Ophthalmology. 83 (3), 358-368 (1999).
  22. Chen, L., Messinger, J. D., Kar, D., Duncan, J. L., Curcio, C. A. Biometrics, impact, and significance of basal linear deposit and subretinal drusenoid deposit in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 62 (1), 33 (2021).
  23. Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).
  24. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protocols. 2008, (2008).
  25. Cornell, W. C., et al. Paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis. Journal of Visualized Experiments. (133), e57196 (2018).
  26. Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. Journal of Visualized Experiments. (139), e58288 (2018).
  27. Baena, V., Schalek, R. L., Lichtman, J. W., Terasaki, M. Serial-section electron microscopy using automated tape-collecting ultramicrotome (ATUM). Methods in Cell Biology. 152, 41-67 (2019).
  28. Yamaguchi, M., Chibana, H. A method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (131), e56235 (2018).
  29. Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433 (2021).
  30. Landowski, M., et al. Modulation of Tmem135 leads to retinal pigmented epithelium pathologies in mice. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 61 (12), 16 (2020).
  31. Mori, H., et al. Developmental and age-related changes to the elastic lamina of Bruch's membrane in mice. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (2), 289-301 (2019).
  32. Chen, M., et al. Retinal pigment epithelial cell multinucleation in the aging eye - a mechanism to repair damage and maintain homoeostasis. Aging Cell. 15 (3), 436-445 (2016).
  33. Ortín-Martínez, A., et al. Number and distribution of mouse retinal cone photoreceptors: differences between an albino (Swiss) and a pigmented (C57/BL6) strain. PLoS One. 9 (7), 102392 (2014).
  34. El-Danaf, R. N., Huberman, A. D. Sub-topographic maps for regionally enhanced analysis of visual space in the mouse retina. The Journal of Comparative Neurology. 527 (1), 259-269 (2019).
  35. Ortolan, D., et al. Single-cell-resolution map of human retinal pigment epithelium helps discover subpopulations with differential disease sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (19), 2117553119 (2022).
  36. Brown, E. E., Lewin, A. S., Ash, J. D. Mitochondria: Potential targets for protection in age-related macular degeneration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 11-17 (2018).
  37. Puk, O., De Angelis, M. H., Graw, J. Longitudinal fundus and retinal studies with SD-OCT: a comparison of five mouse inbred strains. Mammalian Genome. 24 (5-6), 198-205 (2013).
  38. Knott, E. J., Sheets, K. G., Zhou, Y., Gordon, W. C., Bazan, N. G. Spatial correlation of mouse photoreceptor-RPE thickness between SD-OCT and histology. Experimental Eye Research. 92 (2), 155-160 (2011).
  39. Allen, R. S., Bales, K., Feola, A., Pardue, M. T. In vivo structural assessments of ocular disease in rodent models using optical coherence tomography. Journal of Visualized Experiments. (161), e61588 (2020).
  40. Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).

Tags

Questo mese su JoVE numero 193
Un protocollo per valutare e quantificare le patologie dell'epitelio pigmentato retinico in modelli murini di degenerazione maculare legata all'età
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Landowski, M., Grindel, S., Hao, Y., … More

Landowski, M., Grindel, S., Hao, Y., Ikeda, S., Bowes Rickman, C., Ikeda, A. A Protocol to Evaluate and Quantify Retinal Pigmented Epithelium Pathologies in Mouse Models of Age-Related Macular Degeneration. J. Vis. Exp. (193), e64927, doi:10.3791/64927 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter