وصفنا قرار فائقة التصوير طريقة للتحقيق في التنظيم الهيكلي للالدائري FtsZ البكتيرية، جهاز ضروري لانقسام الخلية. ويستند هذا الأسلوب على التحليل الكمي للصور توطين photoactivated (PALM) والمجهر يمكن تطبيقها على هيكل الخلية البكتيرية البروتينات الأخرى.
انقسام الخلايا البكتيرية تتطلب الجمعية المنسق لأكثر من عشر البروتينات الأساسية في midcell 1،2. المركزية في هذه العملية هو تشكيل suprastructure الدائري مثل (Z الدائري) من البروتين FtsZ في خطة تقسيم 3،4. و-Z حلقة تتكون من عدة protofilaments FtsZ واحد الذين تقطعت بهم السبل، وفهم ترتيب protofilaments داخل الدائري Z سوف تقدم نظرة ثاقبة آلية Z الدائري التجمع وظيفتها كما مولد قوة 5،6. ظلت هذه المعلومات بعيد المنال بسبب القيود الحالية في مضان المجهري التقليدية والمجهر الإلكتروني. المجهر مضان التقليدية غير قادرة على توفير صورة عالية الدقة للZ الدائري بسبب الحد حيود الضوء (~ 200 نانومتر). كشف الإلكترون cryotomographic التصوير المنتشرة في protofilaments FtsZ C. الصغيرة الخلايا crescentus 7، ولكن من الصعب تطبيقها على خلايا أكبر مثلكولاي أو B. الرقيقة. نحن هنا وصف تطبيق طريقة فائقة القرار المجهري مضان، Photoactivated المجهر الأقلمة (PALM)، لوصف كميا التنظيم الهيكلي للE. القولونية Z الدائري 8.
PALM التصوير يقدم كل وارتفاع القرار المكانية (~ 35 نانومتر) ووضع العلامات المحددة لتمكين تحديد لا لبس فيها من البروتينات المستهدفة. وصفت ونحن FtsZ مع mEos2 بروتين فلوري photoactivatable، التي تتحول من الأخضر مضان (الإثارة = 488 نانومتر) لمضان أحمر (561 نانومتر الإثارة =) عند تفعيل في 405 نانومتر 9. خلال التجربة PALM، يتم تنشيط عشوائيا واحد FtsZ-mEos2 الجزيئات ويتم تحديد المواقف المقابلة النقطة الوسطى للجزيئات واحدة مع الدقة <20 نانومتر. وأعيد بناؤها ثم صورة القرار فائقة للZ الدائري قبل التركيب المواقف النقطة الوسطى من جميع الجزيئات الكشف-mEos2 FtsZ.
<ف الطبقة = "jove_content"> استخدام هذا الأسلوب، وجدنا أن لديه Z الدائري عرض ثابت من 100 نانومتر ~ ويتكون من حزمة فضفاضة من protofilaments FtsZ التي تتداخل مع بعضها البعض في ثلاثة أبعاد. هذه البيانات توفر نقطة انطلاق لمزيد من التحقيقات من التغييرات دورة الخلية تعتمد على ال 10 Z الدائري ويمكن تطبيقها على البروتينات الأخرى ذات الاهتمام.PALM الصور تحتوي على معلومات حول التهم جزيء والمواقف داخل الخلية، مما يسمح تحليل مفصل لتوزيع وترتيب جزيئات البروتين الهدف الذي من الصعب تحقيقه من خلال وسائل أخرى. أدناه الخطوط العريضة ونحن الاحتياطات التي ينبغي اتخاذها لاستخراج معلومات كمية دقيقة مع المحافظة على أهم?…
The authors have nothing to disclose.
المنحة: 5RO1GM086447-02.
Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
50 x MEM Amino Acids | Sigma | M5550 | |
100 x MEM Vitamins | Sigma | M6895 | |
IPTG | Mediatech | 46-102-RF | |
16% Paraformaldehyde | Electron Micrsocopy Sciences | 15710-S | |
SeaPlaque GTG Agarose | Lonzo | 50111 | |
50 nm Gold Beads | Microspheres-Nanospheres | 790113-010 | |
FCS2 Imaging Chamber | Bioptechs | ||
Stage Adaptor | ASI | I-3017 | |
Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
1.45 NA, 60x Objective | Olympus | ||
IXON EMCCD Camera | Andor Technology | DU897E | |
488-nm Sapphire Laser | Coherent | ||
561-nm Sapphire Laser | Coherent | ||
405-nm CUBE Laser | Coherent |