Super-Resolution Imaging бактериального Машины отдела
Summary
Мы описываем супер-разрешение изображения методом для исследования структурной организации бактериальных FtsZ-кольцо, существенную устройство для деления клеток. Этот метод основан на количественном анализе фотоактивированного локализации микроскопии (PALM) изображений и может быть применен в других бактериальных белков цитоскелета.
Abstract
Бактериальные деления клеток требует скоординированных сборки из более чем десяти основных белков в midcell 1,2. Центральное место в этом процессе является формирование кольцевых супраструктуры (Z-кольцо) белком FtsZ в плане разделения 3,4. Z-кольцо состоит из нескольких одноцепочечной протофиламентов FtsZ, и понимание расположения протофиламентов внутри Z-кольцо обеспечит понимание механизма Z-кольцо в сборе и его функции как сила, генератор 5,6. Эта информация осталась неуловимой из-за существующих ограничений в обычной флуоресцентной микроскопии и электронной микроскопии. Обычные флуоресцентной микроскопии не в состоянии обеспечить высокое разрешение изображения Z-кольцо из-за дифракционного предела света (~ 200 нм). Электрон cryotomographic изображений обнаружено разбросаны FtsZ протофиламентов в небольших C. crescentus клеток 7, но трудно применять на больших клетках, таких какE.coli или B. Сенная. Здесь мы описываем применение супер-разрешение флуоресцентного метода микроскопии, фотоактивированного микроскопии локализации (PALM), количественно характеризующие структурную организацию E. палочки Z-кольцо 8.
PALM изображений предлагает как высоким пространственным разрешением (~ 35 нм) и конкретные маркировки чтобы однозначной идентификации белков-мишеней. Мы назвали FtsZ с фотоактивируемых флуоресцентного белка mEos2, который переключается с зеленой флуоресценции (возбуждение = 488 нм) до красной флуоресценции (возбуждение = 561 нм) при активации при 405 нм 9. Во время эксперимента PALM, одна FtsZ-mEos2 молекул стохастически активируется и соответствующая тяжести положения отдельных молекул определяется с <20 нм точность. Супер-разрешение изображения Z-кольцо, затем реконструирован путем наложения тяжести позиций всех обнаруженных FtsZ-mEos2 молекул.
<р = класса "jove_content"> Используя этот метод, мы обнаружили, что Z-кольцо имеет фиксированную ширину ~ 100 нм и состоит из свободных расслоение протофиламентов FtsZ, которые перекрывают друг с другом в трех измерениях. Эти данные служат трамплином для дальнейших исследований клеточного цикла зависимости изменения Z-кольцо 10 и может быть применен к другим белкам интерес.Protocol
Representative Results
Discussion
PALM изображения содержат информацию о молекуле счета и позиции внутри клетки, что позволяет детальный анализ распределения и расположения молекул белка-мишени, которую трудно достичь другими средствами. Ниже мы приводим меры предосторожности, которые должны быть приняты для извлечен?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Грант: 5RO1GM086447-02.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| 50 x MEM Amino Acids | Sigma | M5550 | |
| 100 x MEM Vitamins | Sigma | M6895 | |
| IPTG | Mediatech | 46-102-RF | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Micrsocopy Sciences | 15710-S | |
| SeaPlaque GTG Agarose | Lonzo | 50111 | |
| 50 nm Gold Beads | Microspheres-Nanospheres | 790113-010 | |
| FCS2 Imaging Chamber | Bioptechs | ||
| Stage Adaptor | ASI | I-3017 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| 1.45 NA, 60x Objective | Olympus | ||
| IXON EMCCD Camera | Andor Technology | DU897E | |
| 488-nm Sapphire Laser | Coherent | ||
| 561-nm Sapphire Laser | Coherent | ||
| 405-nm CUBE Laser | Coherent |
References
- Buddelmeijer, N., Beckwith, J. Assembly of cell division proteins at the E. coli cell center. Curr. Opin. Microbiol. 5, 553-557 (2002).
- de Boer, P., Crossley, R., Rothfield, L. The essential bacterial cell-division protein FtsZ is a GTPase. Nature. 359, 254-256 (1992).
- Lutkenhaus, J. F., Wolf-Watz, H., Donachie, W. D. Organization of genes in the ftsA-envA region of the Escherichia coli genetic map and identification of a new fts locus (ftsZ). J. Bacteriol. 142, 615-620 (1980).
- Bi, E. F., Lutkenhaus, J. FtsZ ring structure associated with division in Escherichia coli. Nature. 354, 161-164 (1991).
- Erickson, H. P., Taylor, D. W., Taylor, K. A., Bramhill, D. Bacterial cell division protein FtsZ assembles into protofilament sheets and minirings, structural homologs of tubulin polymers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 519-523 (1996).
- Osawa, M., Anderson, D. E., Erickson, H. P. Reconstitution of contractile FtsZ rings in liposomes. Science. 320, 792-794 (2008).
- Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division. Embo J. 26, 4694-4708 (2007).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nat. Methods. 6, 131-133 (2009).
- Fu, G., et al. In-vivo FtsZ-ring structure revealed by Photoactivated Localization Microisocpy (PALM). Plos One. , (2010).
- Huecas, S., et al. Energetics and geometry of FtsZ polymers: nucleated self-assembly of single protofilaments. Biophys. J. , (2007).
- Ma, X., Ehrhardt, D. W., Margolin, W. Colocalization of cell division proteins FtsZ and FtsA to cytoskeletal structures in living Escherichia coli cells by using green fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 12998-13003 (1996).
- Dai, K., Lutkenhaus, J. The proper ratio of FtsZ to FtsA is required for cell division to occur in Escherichia coli. J. Bacteriol. 174, 6145-6151 (1992).
- Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy. Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
