Super-resolución de imagen de la maquinaria de división bacteriana
Summary
Se describe un super-resolución método de imagen para sondear la organización estructural de la bacteriana FtsZ-anillo, un aparato esencial para la división celular. Este método se basa en análisis cuantitativos de fotoactivados microscopía de localización (palma) y las imágenes se puede aplicar a otras proteínas del citoesqueleto bacterianas.
Abstract
La división celular bacteriana requiere el montaje coordinada de más de diez proteínas esenciales en midcell 1,2. Fundamental en este proceso es la formación de una supraestructura de tipo anillo (anillo Z) por la proteína FtsZ en el plan de división de 3,4. El anillo Z se compone de varios monocatenarios protofilamentos FtsZ, y la comprensión de la disposición de los protofilamentos dentro del anillo Z proporcionará información sobre el mecanismo de anillo Z ensamblaje y su función como un generador de fuerza 5,6. Esta información ha permanecido esquiva debido a las limitaciones actuales en la microscopía de fluorescencia convencional y microscopía electrónica. Microscopía de fluorescencia convencional es incapaz de proporcionar una imagen de alta resolución de la Z-ring debido al límite de difracción de la luz (~ 200 nm). Electrónica cryotomographic imágenes ha detectado disperso en pequeñas protofilamentos FtsZ C. células crescentus 7, pero es difícil de aplicar a células más grandes, tales comoE. coli o B. subtilis. Aquí se describe la aplicación de un método de microscopía de super-resolución de fluorescencia, microscopía de localización fotoactivado (palma), para caracterizar cuantitativamente la organización estructural de la E. coli Z-anillo 8.
PALM imagen ofrece una alta resolución espacial (~ 35 nm) y el etiquetado específico para permitir la identificación inequívoca de proteínas diana. Hemos marcado FtsZ con la mEos2 proteína fluorescente fotoactivable, que cambia de verde de fluorescencia (excitación = 488 nm) al rojo de fluorescencia (excitación = 561 nm) tras la activación a 405 nm 9. Durante un experimento PALM, solo FtsZ-mEos2 moléculas se activan y estocásticamente las posiciones correspondientes centroides de las moléculas individuales se determinan con precisión <20 nm. Una imagen de super-resolución de la Z-ring se reconstruye mediante la superposición de las posiciones del centroide de todos los detectados FtsZ-mEos2 moléculas.
<clase p = "jove_content"> Usando este método, se encontró que el anillo Z tiene un ancho fijo de ~ 100 nm y se compone de un paquete suelto de protofilamentos FtsZ que se solapan entre sí en tres dimensiones. Estos datos proporcionan una plataforma para futuras investigaciones de los cambios del ciclo celular dependientes de la 10 Z-anillo y se puede aplicar a otras proteínas de interés.Protocol
Representative Results
Discussion
PALM imágenes contienen información acerca de los recuentos y las posiciones de moléculas dentro de una célula, permitiendo un análisis detallado de la distribución y la disposición de las moléculas de proteína diana que es difícil de lograr por otros medios. A continuación detallamos las precauciones que se deben tomar para extraer información cuantitativa precisa, manteniendo la relevancia biológica de las imágenes de palma. También explorar la información que puede obtenerse mejor utilizando células …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Grant: 5RO1GM086447-02.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| 50 x MEM Amino Acids | Sigma | M5550 | |
| 100 x MEM Vitamins | Sigma | M6895 | |
| IPTG | Mediatech | 46-102-RF | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Micrsocopy Sciences | 15710-S | |
| SeaPlaque GTG Agarose | Lonzo | 50111 | |
| 50 nm Gold Beads | Microspheres-Nanospheres | 790113-010 | |
| FCS2 Imaging Chamber | Bioptechs | ||
| Stage Adaptor | ASI | I-3017 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| 1.45 NA, 60x Objective | Olympus | ||
| IXON EMCCD Camera | Andor Technology | DU897E | |
| 488-nm Sapphire Laser | Coherent | ||
| 561-nm Sapphire Laser | Coherent | ||
| 405-nm CUBE Laser | Coherent |
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