Descreve-se um método de resolução super-imaging para sondar a organização estrutural da bacteriano FtsZ-ring, um aparelho essencial para a divisão celular. Este método baseia-se em análises quantitativas de microscopia fotoativados localização (PALM) imagens e pode ser aplicado a outras proteínas do citoesqueleto bacterianas.
A divisão celular bacteriana requer a montagem coordenada de mais de dez proteínas essenciais para midcell 1,2. Central neste processo é a formação de um anel supraestrutura-like (Z-ring) pela proteína FtsZ no plano de divisão 3,4. O anel Z é constituída por múltiplas protofilamentos single-stranded FtsZ, e compreendendo o arranjo dos protofilamentos dentro do Z-ring irão fornecer indicações acerca do mecanismo de Z-anel de montagem e a sua função como um gerador de força de 5,6. Esta informação permaneceu uma incógnita devido a limitações atuais em microscopia de fluorescência convencional e microscopia eletrônica. A microscopia de fluorescência convencional não é capaz de fornecer uma imagem de alta resolução do Z-ring devido ao limite de difracção de luz (~ 200 nm). Electron cryotomographic imagem detectou espalhados protofilamentos FtsZ em C. pequena células crescentus 7, mas é difícil de aplicar a células maiores, tais comoE. coli ou B. subtilis. Aqui, descrevemos a aplicação de um método de microscopia de fluorescência de super-resolução, microscopia fotoativados localização (PALM), para caracterizar quantitativamente a organização estrutural do E. coli Z-ring 8.
PALM oferece imagens de alta resolução espacial (~ 35 nm) e rotulagem específica para permitir a identificação inequívoca de proteínas-alvo. Nós FtsZ rotulados com a proteína mEos2 fotoactivável fluorescente, a qual muda de verde de fluorescência (excitação = 488 nm) para vermelho de fluorescência (excitação = 561 nm) após a activação a 405 nm 9. Durante uma experiência de palma, individuais FtsZ-mEos2 moléculas são estocasticamente activado e as posições correspondentes do centróide das moléculas individuais são determinadas com <precisão nm 20. Uma imagem de super-resolução do anel Z é então reconstruído por sobrepondo as posições de todos os centróide detectados FtsZ-mEos2 moléculas.
<p class = "jove_content"> Usando este método, verificou-se que o Z-ring tem uma largura fixa de ~ 100 nm e é composto por um feixe de protofilamentos FtsZ solto que se sobrepõem uns aos outros, em três dimensões. Estes dados fornecem um trampolim para outras investigações das alterações do ciclo celular dependentes da 10 Z-anel e pode ser aplicado a outras proteínas de interesse.Imagens PALM contêm informações sobre as contagens de moléculas e posições dentro de uma célula, permitindo uma análise detalhada da distribuição e arranjo de moléculas de proteína alvo que é difícil de conseguir por outros meios. Abaixo destacamos as precauções que devem ser tomadas para extrair informações quantitativas precisas, mantendo a relevância biológica de imagens de palma. Nós também explorar a informação que pode ser melhor obtidos utilizando células vivas vs fixo. Por fim, sugerimos…
The authors have nothing to disclose.
Grant: 5RO1GM086447-02.
Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
50 x MEM Amino Acids | Sigma | M5550 | |
100 x MEM Vitamins | Sigma | M6895 | |
IPTG | Mediatech | 46-102-RF | |
16% Paraformaldehyde | Electron Micrsocopy Sciences | 15710-S | |
SeaPlaque GTG Agarose | Lonzo | 50111 | |
50 nm Gold Beads | Microspheres-Nanospheres | 790113-010 | |
FCS2 Imaging Chamber | Bioptechs | ||
Stage Adaptor | ASI | I-3017 | |
Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
1.45 NA, 60x Objective | Olympus | ||
IXON EMCCD Camera | Andor Technology | DU897E | |
488-nm Sapphire Laser | Coherent | ||
561-nm Sapphire Laser | Coherent | ||
405-nm CUBE Laser | Coherent |