超分辨率成像细菌科机械
Summary
我们描述了超分辨率成像方法的细菌FtsZ的环探测的组织结构，细胞分裂的重要设备。这种方法是基于光活化的定位显微镜（PALM）图像的定量分析，并可以应用到其他的细菌的细胞骨架蛋白。
Abstract
细菌细胞分裂需要协调的装配超过10种必需的蛋白质，在midcell 1,2。这个过程的核心是形成一个环形的表壳构造（Z-环）的FtsZ蛋白的划分方案3,4。的Z-环由多个单链FtsZ的原丝，并理解的Z-环内的原丝的配置将提供洞察作为力发生器5,6 Z-环组件和它的功能的机制。此信息一直难以实现，由于目前的限制，在传统的荧光显微镜和电子显微镜。无法提供一个高分辨率图像的Z-环，由于光的衍射极限（〜200 nm）的常规的荧光显微镜。电子cryotomographic成像检测散FtsZ的原丝在小C. crescentus的电池7，但很难适用于较大的细胞，例如大肠杆菌或 B。 枯草芽孢杆菌 。在这里，我们描述了一个超高分辨率荧光显微镜方法的应用，光敏定位显微镜（PALM），定量表征的组织结构的E.大肠杆菌 Z-环8。
PALM成像可以同时提供高的空间分辨率（〜35纳米）和特定的标签，使靶蛋白的明确识别。我们标记FtsZ的可光活化的荧光蛋白mEos2，切换到绿色荧光（激发波长= 488纳米）的红色荧光（激发波长= 561纳米）激活后在405 nm 9。在一个PALM试验，单的FtsZ，mEos2分子，随机激活，相应的单分子质心的位置确定精度<20纳米。甲的超分辨率图像的Z-环然后重建通过叠加的质心位置的所有检测到的FtsZ-mEos2分子。
<p类=的“jove_content”>使用这种方法，我们发现，在Z-环具有一个固定的宽度为100 nm，并组成一个松散捆FtsZ的原丝，在三维空间中彼此重叠。这些数据提供了进一步调查的跳板的Z形环10的细胞周期依赖性变化，并可以应用到其他感兴趣的蛋白质。Protocol
1。样品制备应变JB281的单菌落接种LB培养基[BW25113 / pJB042（P 紫胶 ：的FtsZ的mEos2）]。在振动机中生长过夜，在37℃下文化1:1,000稀释到M9 +最小的媒体M9盐，0.4％葡萄糖，2毫米硫酸镁 ，0.1毫米氯化钙 ，MEM氨基酸和维生素]和成长中旬至对数生长期（OD 600 = 0.2-0.3）氯霉素（150微克/毫升）的存在下，在室温（RT）。 诱导文化与20μMIPTG 2小时（…
Representative Results
在图3Aiv是示出一个两维的，超分辨率渲染从PALM的成像方法，如上所述，产生的Z-环。下面，我们总结可以由它们得到的定性和定量信息。 定性地说，我们观察到的Z形环是一个不规则的结构，该结构采用在常规的荧光图像（比较图3A-DII和iv）是无法区分的多个配置（单一条带或螺旋形的弧）。如这些观察可以被用来确定该细胞群的百分比，显示一个特…
Discussion
PALM图像包含有关分子计数和在小区内的位置的信息，允许的靶蛋白分子的分布和排列是难以通过其他方式实现的详细分析。下面，我们列出了应采取的预防措施，提取准确的定量信息，同时保持生物PALM图像的相关性。我们还探索能最好地利用活细胞与固定的信息。最后，我们建议的渠道，获得额外的超分辨率细胞分裂机械信息。
上面描述的方法进行了优化，以产生精确的PA…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
格兰特：5RO1GM086447 02。
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| 50 x MEM Amino Acids | Sigma | M5550 | |
| 100 x MEM Vitamins | Sigma | M6895 | |
| IPTG | Mediatech | 46-102-RF | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Micrsocopy Sciences | 15710-S | |
| SeaPlaque GTG Agarose | Lonzo | 50111 | |
| 50 nm Gold Beads | Microspheres-Nanospheres | 790113-010 | |
| FCS2 Imaging Chamber | Bioptechs | ||
| Stage Adaptor | ASI | I-3017 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| 1.45 NA, 60x Objective | Olympus | ||
| IXON EMCCD Camera | Andor Technology | DU897E | |
| 488-nm Sapphire Laser | Coherent | ||
| 561-nm Sapphire Laser | Coherent | ||
| 405-nm CUBE Laser | Coherent |
References
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Cite This Article
Buss, J., Coltharp, C., Xiao, J. Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery. J. Vis. Exp. (71), e50048, doi:10.3791/50048 (2013).