Un procédé de précipitation modification pour isoler les exosomes urinaire
Summary
This manuscript describes a protocol for isolating exosomes from human urine using a modified precipitation technique.
Abstract
Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. Urinary exosome vesicles, 40-100 nm in size, are released into the urine under normal conditions by cells from all nephron segments and may contain protein, mRNA and microRNA representative of their cell type of origin. Under conditions of renal dysfunction or injury, exosomes may contain altered proportions of these components, which may serve as biomarkers for disease. There are currently several methods available for isolation of urinary exosomes, and we have previously conducted an experimental comparison of each of these approaches, including three based on ultracentrifugation, one using a nanomembrane ultrafiltration concentrator, one using a commercial precipitation reagent and one using a modification of the precipitation technique using ExoQuick reagent that we developed in our laboratory. We found the modified precipitation method produced the highest yield of exosome particles, miRNA, and mRNA, making this approach suitable for the isolation of exosomes for subsequent RNA profiling. We conclude that the modified exosome precipitation method offers a quick, scalable, and effective alternative for the isolation of exosomes from urine. In this report, we describe our modified precipitation technique using ExoQuick reagent for isolating exosomes from human urine.
Introduction
Exosomes urinaires sont de petites vésicules internes de 100 nm de corps multivésiculaires (MVB) provenant de tous les types de cellules dans des conditions normales et pathologiques dans l'espace urinaire y compris podocytes glomérulaires, les cellules des tubules rénaux et les cellules qui tapissent les systèmes de drainage urinaire qui semblent être enrichi pour miARN 1 -2. De nombreux chercheurs ont détecté des protéines distinctes dans exosomes isolés à partir de l'urine d'individus sains ainsi que ceux atteints d'insuffisance rénale et / ou de maladies systématiques 3-5. Les exosomes peuvent être isolés en utilisant différentes méthodes telles que deux étapes ultracentrifugation différentielle avec ou sans saccharose 6-7, combinant filtre nanomembrane avec ultracentrifugation 8-9, 10-11 ou précipitation. Nous avons récemment développé une méthode simple, rapide, évolutive et efficace pour isoler les exosomes urinaires et de détecter les miARN et des biomarqueurs protéiques 11. Bien que les biomarqueurs peuvent être détectés dans une variété de différents fluides biologiques, urine est le choix le plus pratique pour les patients atteints de maladies du rein et des voies urinaires, car il peut être obtenu en grandes quantités d'une manière relativement non invasive.
Bien qu'il existe plusieurs méthodes pour isoler les exosomes urinaires 6-11, le procédé le plus couramment utilisé dépend ultracentrifugation différentielle avec un coussin de saccharose à 30%. Bien que cette méthode soit efficace et la qualité des exosomes isolés résultant de cette procédure est élevée, la technique elle-même requiert un personnel qualifié et prend beaucoup de temps, ce qui nécessite plusieurs étapes d'ultracentrifugation. D'autres méthodes, telles que la filtration et la précipitation, ont été développés pour l'isolement d'exosomes, y compris une qui utilise un réactif de précipitation propriétaire (ce est à dire, ExoQuick-TC: Biosciences système; Mountain View, CA). Bien que les précipitations en utilisant ce réactif est rapide et relativement facile, la pureté des exosomes isolés est faible par rapport à la meth ultracentrifugationod. Récemment, nous avons comparé les six procédés pour l'isolement d'exosomes urinaires, y compris une modification de la méthode de précipitation au moyen ExoQuick-TC que nous avons développé dans notre laboratoire 11. Nous avons constaté que cette méthode de précipitation modifiée a donné de plus grandes quantités de protéines, de miARN et ARNm et la procédure elle-même était plus rapide et plus facile à mettre en œuvre que ultracentrifugation. Ici, nous décrivons le protocole expérimental de notre méthode de précipitation modifiée de manière progressive, et inclure une discussion sur les avantages et les inconvénients de cette technique par rapport à d'autres méthodes d'isolement de exosomes. Le procédé de précipitation modifié implique une précipitation initiale de particules d'exosomes, suivie de l'élimination de la protéine de Tamm-Horsfall, qui est corrélée avec des protéines exosomales, et connu pour réduire le rendement des exosomes à partir d'urine. Nous avons constaté que ces modifications ont augmenté le rendement et la pureté de la préparation de exosomal de l'urine.
Protocol
Representative Results
Discussion
La plupart des procédés impliquant la précipitation des exosomes à partir d'urine ne abordent pas le retrait du réseau polymère formé par la protéine de Tamm-Horsfall (THP). Cette protéine est présente en grandes quantités dans l'urine, où il pièges putativement exosomes pendant la centrifugation à basse vitesse initiale. Dans notre méthode modifiée, nous avons réduit THP utilisant la TNT avant la précipitation exosomes. Comme le montre la Figure 2, une plus grande quantité de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to the Roney Family Foundation for the support of this study. We acknowledge the contribution of Dr. M. Lucrecia Alvarez to the planning and execution of the experiments described in this work.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Corning 15ml Centrifuge Tube | Corning (Sigma Aldrich) | CLS430791 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | P8340 | |
| Centrifuge | Sorvall | ||
| DL-dithiothreitol | Sigma Aldrich | D9779 | used at final concentration of 200 mg/ml |
| Novex NuPAGE SDS-PAGE system (4-12 % Bis-Tris Gel 1.0 mm, 10 well | Invitrogen | NP0321BOX | For SDS-PAGE analysis |
| ECL Advance Western blotting detection kit | GE Healthcare Life Sciences | RPN2135 | For western blot detection of biomarkers |
| Exoquick-TC Reagent | System Biosciences (SBI) | EXOTC50A-1 | For exosome isolation |
| Exosome CD9 ELISA Complete Kit | System Biosciences (SBI) | EXOEL-CD9-A-1 | For exosome quantification |
| AllPrep DNA/RNA/Protein mini kit | Qiagen | 80004 | For DNA, RNA, Protein isolation |
| Rneasy MinElute Cleanup kit | Qiagen | 74204 | |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | For Protein Quantification | |
| ProteoSilver Sliver Stain Kit | Sigma Aldrich | PROTSIL1-1KT | For staining SDS-PAGE gels |
| Xcell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Life Technologies | For running the SDS-PAGE gels | |
| TaqMan microRNA assays | Life Technologies | For RT-PCR assays | |
| qBasePlus v1.5 software | Biogazelle NV | For analysis of RT-PCR assay data | |
| Rabbit polyclonal antibody to ALIX | Millipore | For western blot detection of biomarkers | |
| Mouse monoclonal antibody to TSG101 | Abcam | For western blot detection of biomarkers |
References
- Miranda, K. C., Bond, D. T., McKee, M. Nucleic acids within urinary exosomes/microvesicles are potential biomarkers for renal disease. Kidney Int. 78, 191-199 (2010).
- Pisitkun, T., Shen, R. F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 13368-13373 (2004).
- Raj, D. A., Fiume, I., Capasso, G., Pocsfalvi, G. A multiplex quantitative proteomics strategy for protein biomarker studies in urinary exosomes. Kidney Int. 81 (12), 1263-1273 (2012).
- Pisitkun, T., Gandolfo, M. T., Das, S., Knepper, M. A., Bagnasco, S. M. Application of systems biology principles to protein biomarker discovery: urinary exosomal proteome in renal transplantation. Proteomics Clin Appl. 6 (5-6), 268-278 (2012).
- Gonzales, P. A., Zhou, H., Pisitkun, T. Isolation and purification of exosomes in urine. Methods Mol Biol. 641, 89-99 (2010).
- Zhou, H., Yuen, P. S., Pisitkun, T. Collection, storage, preservation, and normalization of human urinary exosomes for biomarker discovery. Kidney Int. 69, 1471-1476 (2006).
- Thery, C., Amigorena, S., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Prot Cell Biol. 43, 3.22.1-3.22.29 (2006).
- Cheruvanky, A., Zhou, H., Pisitkun, T. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. Am J Physiol Renal Physiol. 292, 1657-1661 (2007).
- Gonzales, P. A., Pisitkun, T., Hoffert, J. D. Large-scale proteomics and phosphoproteomics of urinary exosomes. J Am Soc Nephrol. 20, 363-379 (2009).
- Rood, I. M., Deegens, J. K., Merchant, M. L. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney Int. 78, 810-816 (2010).
- Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney Int. Nov. 82 (9), 1024-1032 (2012).
- Kang, S. W., Kim, Y. W., Kim, Y. H. Study of the association of -667 aquaporin-2 (AQP-2) A/G promoter polymorphism with the incidence and clinical course of chronic kidney disease in Korea. Renal Fail. 29, 693-698 (2007).
