수정 된 침전 법은 요도 엑소 좀을 분리
Summary
This manuscript describes a protocol for isolating exosomes from human urine using a modified precipitation technique.
Abstract
Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. Urinary exosome vesicles, 40-100 nm in size, are released into the urine under normal conditions by cells from all nephron segments and may contain protein, mRNA and microRNA representative of their cell type of origin. Under conditions of renal dysfunction or injury, exosomes may contain altered proportions of these components, which may serve as biomarkers for disease. There are currently several methods available for isolation of urinary exosomes, and we have previously conducted an experimental comparison of each of these approaches, including three based on ultracentrifugation, one using a nanomembrane ultrafiltration concentrator, one using a commercial precipitation reagent and one using a modification of the precipitation technique using ExoQuick reagent that we developed in our laboratory. We found the modified precipitation method produced the highest yield of exosome particles, miRNA, and mRNA, making this approach suitable for the isolation of exosomes for subsequent RNA profiling. We conclude that the modified exosome precipitation method offers a quick, scalable, and effective alternative for the isolation of exosomes from urine. In this report, we describe our modified precipitation technique using ExoQuick reagent for isolating exosomes from human urine.
Introduction
소변 엑소 좀은 miRNA가 1 농축 한 것으로 나타났습니다 소변 배수 시스템을 긋고 사구체 족 세포, 신장 세뇨관 세포와 세포를 포함 비뇨기 공간에서 정상 및 병적 인 상태에서 모든 종류의 세포에서 파생 된 multivesicular 기관 (MVB)의 100 나노 미터의 작은 내부 소포 있습니다 -2. 많은 연구자들은 건강한 사람의 소변뿐만 아니라 신장 및 / 또는 체계적인 질병에 3-5 가진 사람에서 분리 된 엑소 좀에 별개의 단백질을 발견했다. 엑소 좀은 8-9 초 원심 분리 또는 침전에 10-11 nanomembrane 필터를 조합, 예컨대 수크로오스 또는 6-7없이 두 단계 차동 초 원심 분리 등의 다양한 방법을 이용하여 분리 할 수있다. 우리는 최근에 소변 엑소 좀을 격리하며 miRNA의 단백질 바이오 마커 (11)를 검출하는, 간단하고, 빠르고, 확장 가능하고 효과적인 방법을 개발했다. 바이오 마커는 다양한 생물학적 다양한 유체에서 발견 될 수 있지만, UR오프라인은 비교적 비 침습적 방식으로 다량으로 얻을 수 있기 때문에 신장 및 요로 질환 환자를위한 가장 편리한 선택이다.
소변 엑소 좀을 6-11을 분리하는 방법은 여러 가지가 있지만, 가장 일반적으로 사용되는 절차는 30 % 자당 쿠션 차동 초 원심 분리에 따라 달라집니다. 이 방법은 효율적이며,이 절차와 절연 얻어진 엑소 좀의 품질이 높은 반면, 기술 자체는 숙련 된 사람이 필요하고 시간이 많이 소요되는 여러 단계를 초 원심 분리에 필요하다. 여과 및 침전 등의 다른 방법은, 독점적 인 침전 시약을 사용하는 것을 포함하여, 엑소 좀의 분리를 위해 개발 된 (즉, ExoQuick-TC : 시스템 생명 과학, 마운틴 뷰, CA). 이 시약을 사용하여 침전 빠르고 비교적 쉽지만, 절연 엑소 좀의 순도는 초 원심 메트 비해 낮다OD. 최근 우리는 우리 실험실에서 개발 ExoQuick 11-TC를 사용하여 침전 법의 변형을 포함 비뇨기 엑소 좀의 분리를위한 여섯 방법을 비교 하였다. 우리는이 수정 침전 법은 단백질, miRNA의, mRNA를 자체 빠르고 초 원심보다 쉽게 구현했다 절차의 높은 수량을 산출 한 것으로 나타났습니다. 여기, 우리는 단계적으로 수정 된 침전 법의 실험 프로토콜을 설명하고 엑소 분리하는 다른 방법에 비해이 기술의 장점과 단점에 대한 논의를 포함한다. 변성 침전 법은 exosomal 단백질과 상관하고, 소변 엑소 수율을 감소하는 것으로 알려져 탬-Horsfall 단백질 제거하여 엑소 입자의 초기 침전을 포함한다. 우리는 이러한 수정은 소변에서 exosomal 준비의 수율과 순도를 증가 것을 발견했다.
Protocol
Representative Results
Discussion
소변에서 엑소 좀 침전을 포함하는 대부분의 방법은 탬-Horsfall 단백질 (THP)에 의해 형성되는 고분자 네트워크의 제거를 해결하지 않습니다. 이 단백질은 추정되는 트랩 초기 저속 원심 엑소 좀 동안 소변에 다량으로 존재한다. 수정 된 방법에서 우리는 엑소 침전하기 전에 DTT를 사용하여 THP를 감소시켰다. 도 2에 도시 된 바와 같이, THP 더 많은 양이 단백질의 제거를 나타내는, 최종 상?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to the Roney Family Foundation for the support of this study. We acknowledge the contribution of Dr. M. Lucrecia Alvarez to the planning and execution of the experiments described in this work.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Corning 15ml Centrifuge Tube | Corning (Sigma Aldrich) | CLS430791 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | P8340 | |
| Centrifuge | Sorvall | ||
| DL-dithiothreitol | Sigma Aldrich | D9779 | used at final concentration of 200 mg/ml |
| Novex NuPAGE SDS-PAGE system (4-12 % Bis-Tris Gel 1.0 mm, 10 well | Invitrogen | NP0321BOX | For SDS-PAGE analysis |
| ECL Advance Western blotting detection kit | GE Healthcare Life Sciences | RPN2135 | For western blot detection of biomarkers |
| Exoquick-TC Reagent | System Biosciences (SBI) | EXOTC50A-1 | For exosome isolation |
| Exosome CD9 ELISA Complete Kit | System Biosciences (SBI) | EXOEL-CD9-A-1 | For exosome quantification |
| AllPrep DNA/RNA/Protein mini kit | Qiagen | 80004 | For DNA, RNA, Protein isolation |
| Rneasy MinElute Cleanup kit | Qiagen | 74204 | |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | For Protein Quantification | |
| ProteoSilver Sliver Stain Kit | Sigma Aldrich | PROTSIL1-1KT | For staining SDS-PAGE gels |
| Xcell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Life Technologies | For running the SDS-PAGE gels | |
| TaqMan microRNA assays | Life Technologies | For RT-PCR assays | |
| qBasePlus v1.5 software | Biogazelle NV | For analysis of RT-PCR assay data | |
| Rabbit polyclonal antibody to ALIX | Millipore | For western blot detection of biomarkers | |
| Mouse monoclonal antibody to TSG101 | Abcam | For western blot detection of biomarkers |
References
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