Un metodo di precipitazione modificata per isolare urinaria Esosomi
Summary
This manuscript describes a protocol for isolating exosomes from human urine using a modified precipitation technique.
Abstract
Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. Urinary exosome vesicles, 40-100 nm in size, are released into the urine under normal conditions by cells from all nephron segments and may contain protein, mRNA and microRNA representative of their cell type of origin. Under conditions of renal dysfunction or injury, exosomes may contain altered proportions of these components, which may serve as biomarkers for disease. There are currently several methods available for isolation of urinary exosomes, and we have previously conducted an experimental comparison of each of these approaches, including three based on ultracentrifugation, one using a nanomembrane ultrafiltration concentrator, one using a commercial precipitation reagent and one using a modification of the precipitation technique using ExoQuick reagent that we developed in our laboratory. We found the modified precipitation method produced the highest yield of exosome particles, miRNA, and mRNA, making this approach suitable for the isolation of exosomes for subsequent RNA profiling. We conclude that the modified exosome precipitation method offers a quick, scalable, and effective alternative for the isolation of exosomes from urine. In this report, we describe our modified precipitation technique using ExoQuick reagent for isolating exosomes from human urine.
Introduction
Esosomi urinari sono piccole vescicole interne di 100 nm di corpi multivescicolari (MVB) derivate da tutti i tipi di cellule in condizioni normali e patologiche nello spazio urinario compresi podocytes glomerulare, cellule tubulari renali e cellule che rivestono le sistemi di drenaggio urinario che sembrano essere arricchito per miRNA 1 -2. Molti ricercatori hanno rilevato proteine distinte in esosomi isolate da urine di soggetti sani e quelli con renale e / o malattie sistematiche 3-5. Esosomi possono essere isolati con metodi diversi, come due fasi ultracentrifugazione differenziale con o senza saccarosio 6-7, combinando filtro nanomembrana con ultracentrifugazione 8-9, 10-11 o precipitazione. Abbiamo recentemente sviluppato un metodo semplice, veloce, scalabile ed efficace per isolare esosomi urinari e rilevare miRNA e biomarcatori proteici 11. Sebbene biomarker possono essere rilevati in una varietà di diversi fluidi biologici, urine è la scelta più conveniente per i pazienti con malattie del rene e del tratto urinario perché può essere ottenuta in grandi quantità in modo relativamente non invasivo.
Anche se ci sono diversi metodi per isolare esosomi urinarie 6-11, la procedura più comunemente usato dipende ultracentrifugazione differenziale con un cuscino di saccarosio 30%. Mentre questo metodo è efficiente e la qualità dei exosomes risultanti isolati con questa procedura è alta, la tecnica si richiede personale specializzato ed è, richiede diversi passaggi ultracentrifugazione richiede tempo. Altri metodi, come la filtrazione e precipitazioni, sono stati sviluppati per l'isolamento di esosomi, tra cui uno che utilizza un reagente di precipitazione proprietario (cioè, ExoQuick-TC: Biosciences System; Mountain View, CA). Anche se le precipitazioni usando questo reagente è veloce e relativamente facile, la purezza dei esosomi isolate è basso rispetto alla meth ultracentrifugazioneod. Recentemente abbiamo confrontato sei metodi per l'isolamento di esosomi urinari, tra cui una modifica del metodo di precipitazione mediante ExoQuick-TC, che abbiamo sviluppato nel nostro laboratorio 11. Abbiamo scoperto che questo metodo di precipitazione modificato prodotto maggiori quantità di proteine, miRNA e mRNA e la procedura in sé era più veloce e più facile da implementare che ultracentrifugazione. Qui, descriviamo il protocollo sperimentale del nostro metodo di precipitazione modificato in modo graduale, e comprendono una discussione sui vantaggi e gli svantaggi di questa tecnica rispetto ad altri metodi di isolamento exosome. Il metodo di precipitazione modificato prevede una precipitazione iniziale di particelle exosome, seguita dalla rimozione di proteina di Tamm-Horsfall, che è correlato con le proteine exosomal, e noto per ridurre exosome resa dalle urine. Abbiamo trovato che tali modifiche aumentato la resa e la purezza della preparazione exosomal dall'urina.
Protocol
Representative Results
Discussion
La maggior parte dei metodi che comportano la precipitazione di esosomi da urine non affrontano la rimozione della rete polimerica formata da proteina di Tamm-Horsfall (THP). Questa proteina è presente in grandi quantità nelle urine, dove intrappola putativamente esosomi durante iniziale centrifugazione a bassa velocità. Nel nostro metodo modificato abbiamo ridotto THP con DTT prima precipitazione exosome. Come mostrato in figura 2, una maggiore quantità di THP è stata osservata nelle urine non tra…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to the Roney Family Foundation for the support of this study. We acknowledge the contribution of Dr. M. Lucrecia Alvarez to the planning and execution of the experiments described in this work.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Corning 15ml Centrifuge Tube | Corning (Sigma Aldrich) | CLS430791 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | P8340 | |
| Centrifuge | Sorvall | ||
| DL-dithiothreitol | Sigma Aldrich | D9779 | used at final concentration of 200 mg/ml |
| Novex NuPAGE SDS-PAGE system (4-12 % Bis-Tris Gel 1.0 mm, 10 well | Invitrogen | NP0321BOX | For SDS-PAGE analysis |
| ECL Advance Western blotting detection kit | GE Healthcare Life Sciences | RPN2135 | For western blot detection of biomarkers |
| Exoquick-TC Reagent | System Biosciences (SBI) | EXOTC50A-1 | For exosome isolation |
| Exosome CD9 ELISA Complete Kit | System Biosciences (SBI) | EXOEL-CD9-A-1 | For exosome quantification |
| AllPrep DNA/RNA/Protein mini kit | Qiagen | 80004 | For DNA, RNA, Protein isolation |
| Rneasy MinElute Cleanup kit | Qiagen | 74204 | |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | For Protein Quantification | |
| ProteoSilver Sliver Stain Kit | Sigma Aldrich | PROTSIL1-1KT | For staining SDS-PAGE gels |
| Xcell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Life Technologies | For running the SDS-PAGE gels | |
| TaqMan microRNA assays | Life Technologies | For RT-PCR assays | |
| qBasePlus v1.5 software | Biogazelle NV | For analysis of RT-PCR assay data | |
| Rabbit polyclonal antibody to ALIX | Millipore | For western blot detection of biomarkers | |
| Mouse monoclonal antibody to TSG101 | Abcam | For western blot detection of biomarkers |
References
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