Eine modifizierte Niederschlag Methode zu Urinary Exosomen Isolieren
Summary
This manuscript describes a protocol for isolating exosomes from human urine using a modified precipitation technique.
Abstract
Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. Urinary exosome vesicles, 40-100 nm in size, are released into the urine under normal conditions by cells from all nephron segments and may contain protein, mRNA and microRNA representative of their cell type of origin. Under conditions of renal dysfunction or injury, exosomes may contain altered proportions of these components, which may serve as biomarkers for disease. There are currently several methods available for isolation of urinary exosomes, and we have previously conducted an experimental comparison of each of these approaches, including three based on ultracentrifugation, one using a nanomembrane ultrafiltration concentrator, one using a commercial precipitation reagent and one using a modification of the precipitation technique using ExoQuick reagent that we developed in our laboratory. We found the modified precipitation method produced the highest yield of exosome particles, miRNA, and mRNA, making this approach suitable for the isolation of exosomes for subsequent RNA profiling. We conclude that the modified exosome precipitation method offers a quick, scalable, and effective alternative for the isolation of exosomes from urine. In this report, we describe our modified precipitation technique using ExoQuick reagent for isolating exosomes from human urine.
Introduction
Urinary Exosomen sind kleine interne Bläschen von 100 nm von multivesicular bodies (MVB) von allen Zelltypen unter normalen und pathologischen Bedingungen in Urin-Raum einschließlich der glomerulären Podozyten, Nierentubuluszellen und Zellen entlang der Urindrainage-Systeme, die für die miRNAs 1 angereichert werden angezeigt abgeleitet -2. Viele Forscher haben unterschiedliche Proteine in Exosomen aus dem Urin von gesunden Personen als auch solche mit eingeschränkter Nieren- und / oder systematische Erkrankungen 3-5 getrennt erfasst. Exosomen kann unter Verwendung verschiedener Verfahren, wie zweistufige Differential Ultrazentrifugation mit oder ohne Sucrose 6-7 isoliert werden, die Kombination Nanofilter mit Ultrazentrifugation 8-9 oder Präzipitation 10-11. Vor kurzem haben wir eine einfache, schnelle, skalierbare und effektive Methode zur Behandlung von Harn Exosomen isolieren und zu erkennen miRNA und Protein-Biomarkern 11 entwickelt. Obwohl Biomarker können in einer Vielzahl von verschiedenen biologischen Flüssigkeiten nachgewiesen werden, urine ist die ideale Wahl für Patienten mit Erkrankungen der Niere und der ableitenden Harnwege, weil es in großen Mengen in einem relativ nicht-invasive Art und Weise erhalten werden.
Obwohl es verschiedene Verfahren zur Behandlung von Harn Exosomen isolieren 6-11, hängt die am meisten verwendeten Verfahren auf Differential Ultrazentrifugation mit einer 30% Saccharose-Kissen. Während dieses Verfahren effizient und die Qualität der resultierenden Exosomen mit diesem Verfahren isoliert hoch ist, das Verfahren selbst erfordert geschultes Personal und ist zeitaufwendig und erfordert mehrere Ultrazentrifugationsschritte. Andere Verfahren, wie Filtration und Fällung, wurden für die Isolierung der Exosomen entwickelt worden, einschließlich eine, die einen proprietären Ausfällungsreagenz verwendet (dh ExoQuick-TC: System Biosciences; Mountain View, CA). Obwohl Fällung mit dieser Reagenz schnell und relativ einfach, die Reinheit der Exosomen isoliert ist gering im Vergleich zu der Ultrazentrifugation method. Vor kurzem haben wir sechs Methoden zur Isolierung von Harn Exosomen, einschließlich einer Modifizierung der Fällungsverfahren unter Verwendung ExoQuick-TC, die in unserem Labor entwickelt 11 verglichen. Wir fanden, dass diese modifizierte Präzipitationsverfahren lieferte höhere Mengen an Protein, miRNA, und mRNAs und das Verfahren selbst schneller und einfacher zu implementieren als Ultrazentrifugation war. Hier beschreiben wir die Versuchsprotokoll unserer modifizierten Fällungsverfahren stufenweise, und verfügen über eine Diskussion der Vor- und Nachteile dieser Technik im Vergleich zu anderen Methoden der Exosom Isolation. Das modifizierte Fällungsverfahren beinhaltet eine anfängliche Ausfällung von Exosom-Partikel, gefolgt von der Entfernung Tamm-Horsfall-Protein, das mit exosomalen Proteine korreliert, und bekanntlich exosome Ausbeute von Urin zu verringern. Wir fanden, dass diese Modifikationen erhöht die Ausbeute und Reinheit des exosomalen Präparat aus Urin.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die meisten Verfahren, die Ausfällung der Exosomen aus Urin adressieren nicht die Entfernung des polymeren Netzwerks von Tamm-Horsfall-Protein (THP) gebildet. Dieses Protein ist in großen Mengen im Urin, wo sie mutmaßlich Fallen Exosomen während der anfänglichen Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit vorhanden ist. In unserem modifizierten Methode reduzierten wir THP mit DTT vor Exosom Niederschlag. Wie in Figur 2 gezeigt, wurde eine größere Menge von THP in unverändertem Urin und Pellet b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to the Roney Family Foundation for the support of this study. We acknowledge the contribution of Dr. M. Lucrecia Alvarez to the planning and execution of the experiments described in this work.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Corning 15ml Centrifuge Tube | Corning (Sigma Aldrich) | CLS430791 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | P8340 | |
| Centrifuge | Sorvall | ||
| DL-dithiothreitol | Sigma Aldrich | D9779 | used at final concentration of 200 mg/ml |
| Novex NuPAGE SDS-PAGE system (4-12 % Bis-Tris Gel 1.0 mm, 10 well | Invitrogen | NP0321BOX | For SDS-PAGE analysis |
| ECL Advance Western blotting detection kit | GE Healthcare Life Sciences | RPN2135 | For western blot detection of biomarkers |
| Exoquick-TC Reagent | System Biosciences (SBI) | EXOTC50A-1 | For exosome isolation |
| Exosome CD9 ELISA Complete Kit | System Biosciences (SBI) | EXOEL-CD9-A-1 | For exosome quantification |
| AllPrep DNA/RNA/Protein mini kit | Qiagen | 80004 | For DNA, RNA, Protein isolation |
| Rneasy MinElute Cleanup kit | Qiagen | 74204 | |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | For Protein Quantification | |
| ProteoSilver Sliver Stain Kit | Sigma Aldrich | PROTSIL1-1KT | For staining SDS-PAGE gels |
| Xcell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Life Technologies | For running the SDS-PAGE gels | |
| TaqMan microRNA assays | Life Technologies | For RT-PCR assays | |
| qBasePlus v1.5 software | Biogazelle NV | For analysis of RT-PCR assay data | |
| Rabbit polyclonal antibody to ALIX | Millipore | For western blot detection of biomarkers | |
| Mouse monoclonal antibody to TSG101 | Abcam | For western blot detection of biomarkers |
References
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