שיטת ממטרים השתנה לבודד השתן Exosomes
Summary
This manuscript describes a protocol for isolating exosomes from human urine using a modified precipitation technique.
Abstract
Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. Urinary exosome vesicles, 40-100 nm in size, are released into the urine under normal conditions by cells from all nephron segments and may contain protein, mRNA and microRNA representative of their cell type of origin. Under conditions of renal dysfunction or injury, exosomes may contain altered proportions of these components, which may serve as biomarkers for disease. There are currently several methods available for isolation of urinary exosomes, and we have previously conducted an experimental comparison of each of these approaches, including three based on ultracentrifugation, one using a nanomembrane ultrafiltration concentrator, one using a commercial precipitation reagent and one using a modification of the precipitation technique using ExoQuick reagent that we developed in our laboratory. We found the modified precipitation method produced the highest yield of exosome particles, miRNA, and mRNA, making this approach suitable for the isolation of exosomes for subsequent RNA profiling. We conclude that the modified exosome precipitation method offers a quick, scalable, and effective alternative for the isolation of exosomes from urine. In this report, we describe our modified precipitation technique using ExoQuick reagent for isolating exosomes from human urine.
Introduction
exosomes שתן הוא שלפוחית פנימית קטנה של גופי multivesicular (MVB) נגזרים מכל סוגי התאים בתנאים נורמלים ופתולוגיים בחלל שתן כולל podocytes גלומרולרי, תאי אבובית כליה ותאים המצפים את מערכות ניקוז שתן המופיעות להיות מועשרים לmiRNAs 1 100 ננומטר -2. חוקרים רבים זיהו חלבונים שונים בexosomes מבודד משתן של אנשים בריאים, כמו גם אלה עם כליות ו / או מחלות שיטתיות 3-5. יכול להיות מבודד Exosomes בשיטות שונות כגון ultracentrifugation ההפרש דו-שלבים עם או בלי סוכרוז 6-7, שילוב מסנן nanomembrane עם ultracentrifugation 8-9, או 10-11 ממטרים. יש לנו לאחרונה פיתחתי שיטה פשוטה, מהירה, מדרגי ויעילות לבודד exosomes שתן ולזהות מירנה וסמנים ביולוגי חלבון 11. למרות שניתן לאתרם סמנים ביולוגיים במגוון רחב של נוזלים ביולוגיים שונים, urine הוא הבחירה הנוחה ביותר עבור חולים עם מחלות הכליות ודרכי שתן, כי ניתן להשיג אותו בכמויות גדולות באופן יחסי שאינו פולשנית.
למרות שיש כמה שיטות לבודד exosomes שתן 6-11, ההליך הנפוץ ביותר תלוי בultracentrifugation ההפרש עם 30% כרית סוכרוז. למרות ששיטה זו היא יעילה ואיכות exosomes וכתוצאה מכך מבודדת עם הליך זה היא גבוהה, הטכניקה עצמה דורשת כוח אדם מיומן, והוא, שדורש כמה צעדי ultracentrifugation זמן רב. שיטות אחרות, כגון סינון ומשקעים, פותחו עבור הבידוד של exosomes, כולל אחד שמשתמש מגיב ממטרים קניינית (כלומר, ExoQuick-TC: מערכת Biosciences; Mountain View, CA). למרות משקעים באמצעות מגיב זה הוא מהיר וקל יחסית, טוהר exosomes מבודד הוא נמוך בהשוואה לספיד ultracentrifugationod. לאחרונה לעומת שש שיטות לבידודה של exosomes שתן, כולל שינוי של שיטת המשקעים באמצעות ExoQuick-TC שפיתחנו במעבדה שלנו 11. מצאנו ששיטת משקעים שונה זו הניבה כמויות גבוהות יותר של חלבון, מירנה, וmRNAs וההליך עצמו היה מהיר יותר וקל יותר ליישום מאשר ultracentrifugation. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול הניסוי של שיטת המשקעים שונה שלנו באופן הדרגתי, ונכלול דיון על היתרונות והחסרונות של שיטה זו בהשוואה לשיטות אחרות של בידוד exosome. שיטת המשקעים שונה כרוכה ממטרים ראשוניים של חלקיקי exosome, ואחריו הסרת חלבון התם-Horsfall, אשר מתואם עם חלבוני exosomal, וידוע כדי להפחית את תשואת exosome משתן של. מצאנו ששינויים אלה הגדילו את התשואה וטוהר של הכנת exosomal משתן.
Protocol
Representative Results
Discussion
רוב השיטות הכרוכות במשקעים של exosomes משתן אינן מתייחסות להסרת של רשת פולימרים הוקמה על ידי חלבון התם-Horsfall (THP). חלבון זה נמצא בכמויות גדולות בשתן, שבו מלכודות putatively זה exosomes במהלך צנטריפוגה מהירות נמוכה ראשונית. בשיטה שונה שלנו אנחנו מופחתים THP באמצעות DTT לפני הממטרים exosome…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to the Roney Family Foundation for the support of this study. We acknowledge the contribution of Dr. M. Lucrecia Alvarez to the planning and execution of the experiments described in this work.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Corning 15ml Centrifuge Tube | Corning (Sigma Aldrich) | CLS430791 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | P8340 | |
| Centrifuge | Sorvall | ||
| DL-dithiothreitol | Sigma Aldrich | D9779 | used at final concentration of 200 mg/ml |
| Novex NuPAGE SDS-PAGE system (4-12 % Bis-Tris Gel 1.0 mm, 10 well | Invitrogen | NP0321BOX | For SDS-PAGE analysis |
| ECL Advance Western blotting detection kit | GE Healthcare Life Sciences | RPN2135 | For western blot detection of biomarkers |
| Exoquick-TC Reagent | System Biosciences (SBI) | EXOTC50A-1 | For exosome isolation |
| Exosome CD9 ELISA Complete Kit | System Biosciences (SBI) | EXOEL-CD9-A-1 | For exosome quantification |
| AllPrep DNA/RNA/Protein mini kit | Qiagen | 80004 | For DNA, RNA, Protein isolation |
| Rneasy MinElute Cleanup kit | Qiagen | 74204 | |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | For Protein Quantification | |
| ProteoSilver Sliver Stain Kit | Sigma Aldrich | PROTSIL1-1KT | For staining SDS-PAGE gels |
| Xcell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Life Technologies | For running the SDS-PAGE gels | |
| TaqMan microRNA assays | Life Technologies | For RT-PCR assays | |
| qBasePlus v1.5 software | Biogazelle NV | For analysis of RT-PCR assay data | |
| Rabbit polyclonal antibody to ALIX | Millipore | For western blot detection of biomarkers | |
| Mouse monoclonal antibody to TSG101 | Abcam | For western blot detection of biomarkers |
References
- Miranda, K. C., Bond, D. T., McKee, M. Nucleic acids within urinary exosomes/microvesicles are potential biomarkers for renal disease. Kidney Int. 78, 191-199 (2010).
- Pisitkun, T., Shen, R. F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 13368-13373 (2004).
- Raj, D. A., Fiume, I., Capasso, G., Pocsfalvi, G. A multiplex quantitative proteomics strategy for protein biomarker studies in urinary exosomes. Kidney Int. 81 (12), 1263-1273 (2012).
- Pisitkun, T., Gandolfo, M. T., Das, S., Knepper, M. A., Bagnasco, S. M. Application of systems biology principles to protein biomarker discovery: urinary exosomal proteome in renal transplantation. Proteomics Clin Appl. 6 (5-6), 268-278 (2012).
- Gonzales, P. A., Zhou, H., Pisitkun, T. Isolation and purification of exosomes in urine. Methods Mol Biol. 641, 89-99 (2010).
- Zhou, H., Yuen, P. S., Pisitkun, T. Collection, storage, preservation, and normalization of human urinary exosomes for biomarker discovery. Kidney Int. 69, 1471-1476 (2006).
- Thery, C., Amigorena, S., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Prot Cell Biol. 43, 3.22.1-3.22.29 (2006).
- Cheruvanky, A., Zhou, H., Pisitkun, T. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. Am J Physiol Renal Physiol. 292, 1657-1661 (2007).
- Gonzales, P. A., Pisitkun, T., Hoffert, J. D. Large-scale proteomics and phosphoproteomics of urinary exosomes. J Am Soc Nephrol. 20, 363-379 (2009).
- Rood, I. M., Deegens, J. K., Merchant, M. L. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney Int. 78, 810-816 (2010).
- Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney Int. Nov. 82 (9), 1024-1032 (2012).
- Kang, S. W., Kim, Y. W., Kim, Y. H. Study of the association of -667 aquaporin-2 (AQP-2) A/G promoter polymorphism with the incidence and clinical course of chronic kidney disease in Korea. Renal Fail. 29, 693-698 (2007).
