والمائية الميكروبية Metaproteomics سير العمل: من الخلايا إلى زيتية الببتيدات مناسبة لتحليل يستند الطيف، جنبا إلى جنب الشامل

Summary

This protocol is for the extraction and concentration of protein and DNA from microbial biomass collected from seawater, followed by the generation of tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based proteomic analysis.

Abstract

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and metabolism. Although powerful, metagenomics alone can only elucidate functional potential. On the other hand, metaproteomics enables the description of the expressed in situ metabolism and function of a community. Here we describe a protocol for cell lysis, protein and DNA isolation, as well as peptide digestion and extraction from marine microbial cells collected on a cartridge filter unit (such as the Sterivex filter unit) and preserved in an RNA stabilization solution (like RNAlater). In mass spectrometry-based proteomics studies, the identification of peptides and proteins is performed by comparing peptide tandem mass spectra to a database of translated nucleotide sequences. Including the metagenome of a sample in the search database increases the number of peptides and proteins that can be identified from the mass spectra. Hence, in this protocol DNA is isolated from the same filter, which can be used subsequently for metagenomic analysis.

Introduction

الكائنات الحية الدقيقة في كل مكان وتلعب أدوارا أساسية في دورات الأرض البيولوجية الكيميائية ^1. حاليا، هناك العديد من المناهج الجزيئية المتاحة لتحديد خصائص بنية المجتمع الميكروبي والوظيفة. الأكثر شيوعا هو تحليل 16S الريباسي الجينات تسلسل PCR تضخيم من الحمض النووي البيئية ^2-4. عيوب تحليل الجينات 16S الريباسي هو أنه لا يقدم سوى معلومات عن هوية النشوء والتطور وبنية المجتمع، مع القليل من المعلومات عن وظيفة التمثيل الغذائي. في المقابل، تقترب مثل metagenomics، metatranscriptomics وmetaproteomics تقديم معلومات عن بنية المجتمع والتمثيل الغذائي. توفر Metagenomics، أو تحليل المحتوى الجيني لفيف من الكائنات الحية، معلومات عن هيكل والإمكانات الوظيفية للمجتمع ^5-8. وعلى الرغم من قوة، وهذه الإمكانات الوظيفية قد لا تتوافق مع الأيضيةأنشطة الكائنات الحية. ويمثل النمط الوراثي للكائن التي كتبها جيناته، كل منها يمكن نسخها إلى RNA وكذلك ترجمت إلى البروتين، مما أدى إلى النمط الظاهري. وهكذا، للمساعدة في فهم النشاط الوظيفي الميكروبي في بيئة وتحليل ما بعد الجينوم يجب أن يتم تنفيذ ^9. Metatranscriptomics، أو تحليل النصوص RNA هو مفيد لأنه يكشف الجينات التي تم نسخها في أي بيئة معينة. ومع ذلك، مستويات مرنا لا تتطابق دائما مستويات البروتين يناظرها بسبب تنظيم متعدية، RNA نصف الحياة، وحقيقة أن نسخ متعددة من البروتين يمكن أن تتولد عن كل مرنا ^10.

لهذه الأسباب metaproteomics ومن المسلم به الآن كأداة هامة لعلم الأحياء الدقيقة البيئي. يحلل metaproteomic شيوعا استخدام نهج البروتين طلقات نارية حيث يتم تنقية كاملة القريب من البروتينات في عينة المعقدة وتحليلها في وقت واحد، وعادة من خلال ENالهضم zymatic إلى ببتيدات والتحليل على مطياف الكتلة. يستخدم لاحق جنبا إلى جنب مطياف الكتلة (MS / MS) "البصمات الببتيد" لتحديد تسلسل الببتيد والمحتملين البروتين من أصل بواسطة قاعدة بيانات البروتين البحث (لاستعراض رؤية ^11). لقد حان عمل البروتين شوطا طويلا في السنوات ال 25 الماضية بفضل الزيادة في توافر البيانات الجينومية وزيادة حساسية ودقة الطيف الجماعية والسماح لتحديد البروتين الإنتاجية العالية وتقدير ^11،12. منذ البروتينات هي المنتج النهائي في التعبير الجيني، يمكن للبيانات metaproteomic تساعد في تحديد الكائنات التي تنشط في أي بيئة معينة وما البروتينات فإنهم يعبرون. هذا هو المفيد عند محاولة تحديد كيف يمكن لمجموعة معينة من المتغيرات البيئية سوف تؤثر على النمط الظاهري للكائن الحي أو المجتمع. في وقت مبكر، واستخدمت دراسات metaproteomic يستند إلى MS-MS / في المحيط لتحديد بروتينات معينة في المستهدفةالأنساب الميكروبية، مع أول دراسة تركز على ضوء مدفوعة مضخة البروتون proteorhodopsin في البكتيريا البحرية SAR11 ^13. وفي الآونة الأخيرة، توضيح التحليلات metaproteomic المقارنة التفاضلية أنماط التعبير البروتين بين المجتمعات المعقدة. ومن الأمثلة على ذلك تحديد التحولات الزمنية في عملية التمثيل الغذائي في المناطق الساحلية شمال غرب المحيط الأطلسي ¹⁴ أو شبه الجزيرة القطبية الجنوبية ^5. وقد وصفت دراسات أخرى الاختلافات في أنماط التعبير البروتين عبر النطاقات المكانية، على سبيل المثال، على طول قطاع من الجغرافي من تلفيف المحيط منخفضة في المغذيات إلى نظام الموجات المتقلبة الساحلي مثمرة للغاية ^(15). للحصول على مزيد من الآراء metaproteomics نوصي شنايدر وآخرون (2010) ⁹ ويليامز وآخرون (2014) ^16. كما تم توظيف البروتينات المستهدفة في السنوات الأخيرة لتحديد التعبير من المسارات الأيضية محددة في البيئة ^17،18.

ذره هي ثلاث مراحل رئيسية في التحليل metaproteomic. المرحلة الأولى هي إعداد نموذج، والذي يتضمن جمع العينات، تحلل الخلية وتركيز البروتين. جمع العينات في علم الأحياء المجهرية البحرية غالبا ما ينطوي على ترشيح مياه البحر من خلال ما قبل التصفية لإزالة الخلايا حقيقية النواة أكبر والجزيئات والبكتيريا المرتبطة الجسيمات، تليها الترشيح للقبض على الخلايا الميكروبية تعيش حرة، عادة مع استخدام خرطوشة 0.22 ميكرومتر وحدة تصفية ^19،20. وincased هذه المرشحات في اسطوانة بلاستيكية وسيكون لتحلل الخلايا والبروتين بروتوكول الاستخراج التي يمكن القيام بها داخل وحدة مرشح أن يكون أداة قيمة. مرة واحدة يتم الحصول على الكتلة الحيوية، ويجب أن يكون هي lysed الخلايا للسماح لاستخراج البروتين. يمكن استخدام العديد من الطرق، بما في ذلك غوانيدين، حمض الهيدروكلوريك تحلل ²¹ والصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS) وسائل تحلل المستندة. على الرغم من المنظفات مثل SDS هي فعالة جدا في تعطيل الأغشية والانحلال العديد من أنواع البروتين، concentratiإضافات منخفضة كما يمكن أن تتداخل مع 0.1٪ المصب الهضم من البروتين وتحليل MS ^22. قلق كبير من الآثار السلبية للSDS على كفاءة الهضم التربسين، حل السلطة من العكسي اللوني المرحلة السائلة والأيونات قمع أو تراكم داخل المصدر أيون ^23.

المرحلة الثانية هي تجزئة وتحليل، حيث يتعرضون للبروتينات الهضم الأنزيمي تليها تحليل LC MS / MS، مما أدى إلى نمط تجزئة صباحا / ض التي يمكن استخدامها للتأكد من تسلسل الحمض الأميني الأساسي للالببتيد زيتية الأولي. لا يمكن أن يؤديها أساليب الهضم المختلفة تبعا لأنواع المنظفات المستخدمة، وكذلك المصب سير العمل مطياف الكتلة. في بروتوكول لدينا، ويستخدم 1-D PAGE الكهربائي تليها إزالة SDS من الجل من أجل إزالة أي تلوث المنظفات. تحليل البروتينات التي يصعب إذابة، مثل بروتينات الغشاء، يتطلب استخدام concen عاليةtrations من SDS أو المنظفات الأخرى. وهذا يؤدي إلى مشاكل التوافق مع SDS هلام الكهربائي. إذا كان الهدف من الدراسة يتطلب الإذابة هذه بجد لإذابة البروتينات، ونظام أنبوب هلام يمكن استخدامها ^22،24. يتضمن طريقة أنبوب هلام البروتينات داخل المصفوفة هلام دون استخدام الكهربائي. بعد ذلك يتم إزالة أي المنظفات المستخدمة لإذابة قبل هضم البروتين.

المرحلة الثالثة هي تحليل بيوينفورمتيك. في هذه المرحلة يتم البحث في البيانات الببتيد MS / MS ضد قاعدة بيانات للتسلسل النوكليوتيدات ترجمتها لتحديد الببتيدات والبروتينات موجودة في العينة. تحديد الببتيدات يعتمد على قاعدة بيانات يتم البحث عنها ضد. يتم البحث بيانات metaproteomic البحرية عادة ضد قواعد البيانات تتألف من الجينوم المرجعية والبيانات metagenomic مثل مجموعة البيانات العالمية المحيط أخذ العينات ^25، فضلا عن خلية تضخيم الجينوم واحدة من لى غير المزروعةneages ^26،27. ويمكن أيضا زيادة تحديد البروتين من خلال إدراج تسلسل metagenomic من نفس العينة كما يتضح من البيانات metaproteomic وقد اشتق ^5.

نحن هنا نقدم بروتوكول لتوليد الببتيدات مناسبة لتحليل يستند إلى MS-MS / الكتلة الحيوية الميكروبية التي تم جمعها من طريق الترشيح وتخزينها في محلول استقرار RNA. بروتوكول الموصوفة هنا يسمح للDNA والبروتين لتكون معزولة من نفس العينة حتى يتسنى لجميع الخطوات المؤدية إلى البروتين والأمطار DNA متطابقة. من منظور عملي، مطلوب أقل الترشيح منذ مطلوب مرشح واحد فقط لكل من البروتين واستخراج الحمض النووي. ونود أيضا أن نعترف أنه تم إنشاء هذا البروتوكول من خلال الجمع بين والتكيف وتعديل بروتوكولين المنشورة سابقا. يتم تكييفها الخطوات تحلل الخلية من سايتو وآخرون (2011) ²⁸ ويتم تكييف التربسين في جل هضم مكون من ShevcheNKO وآخرون. (2007) ^29.

Protocol

1. إعداد الكواشف يعد حل SDS-استخراج: 0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك 7.5 درجة الحموضة، 5٪ الجلسرين، و 10 ملي EDTA و 1٪ SDS. فلتر تعقيم باستخدام مرشح 0.22 ميكرون وتخزينها في 4 درجات مئوية. إعداد الكواشف الأسهم…

Representative Results

كما مظاهرة، أجرينا البروتوكول على عينتين مياه البحر التي تم جمعها من سطح والكلوروفيل أقصى المحيط الساحلي في شمال كندا. بينما في عرض البحر، صدر 6-7 L من مياه البحر من خلال 3 ميكرون GF / D prefilter، ثم تم جمع الخلايا الميكروبية على 0.22 ميكرون وحدة تصفية خرطوشة بعد بروتوكول والش <e…

Discussion

الحفاظ على عينة هو المفتاح لدراسات metaproteomic وأظهرت الأعمال السابقة أن الحل استقرار RNA هو عازلة تخزين مفيد لتخزين الخلايا قبل البروتين استخراج ^28. من الناحية المثالية، سوف يتم الحفاظ على عينات في الموقع لنفي التحولات في تعبير البروتين أثناء التعامل مع ^33،34….

Materials

Sterivex -GP 0.22 μm filter unit	Millipore	SVGP01050	Sampling
RNAlater Stabilization Solution	Ambion	AM7021	Sampling
Tris	Bio Basic	77-86-1 or TB0196-500G	Protein Extraction/ SDS PAGE gel
DTT	Sigma-Aldrich	D0632-1G	Protein Extraction
SDS	Bio Basic	15-21-3	Protein Extraction/ SDS PAGE gel
EDTA	Bio Basic	6381-92-6	Protein Extraction
Glycerol	Fisher Scientific	56-81-5	Protein Extraction
10K Amicon Filter	Millipore	UFC801024	Protein Extraction
Methanol	Sigma-Aldrich	179337-4L	Protein Precipitation
Acetone	Fisher Scientific	67-64-1	Protein Precipitation
MPC Protein Precipitation reagent	Epicenter	mmP03750	DNA Precipitation
2-Propanol	Fisher Scientific	67-63-0	DNA Precipitation
Qubit dsDNA BR Assay kit	Life Technologies	Q32850	DNA Quantification
Qubit Protein Assay kit	Life Technologies	Q33211	Protein Quantification
Sucrose	Bio Basic	57-50-1	SDS PAGE gel
TEMED	Bio Rad	161-0800	SDS PAGE gel
APS	Bio Rad	161-0700	SDS PAGE gel
30% Acrylamide	Bio Rad	161-0158	SDS PAGE gel
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060	SDS PAGE gel
Glycine	Bio Rad	161-0718	SDS PAGE gel
B-mercaptoethanol	Bio Basic	60-24-2	SDS PAGE gel
Laemmli Sample Buffer	Bio Rad	161-0737	SDS PAGE gel
Precision Plus Protein Kaleidoscope Ladder	Bio Rad	161-0375EDU	SDS PAGE gel
Acetonitrile	VWR	CABDH6044-4	In-gel Trypsin digest
NH4HCO3	Bio Basic	1066-33-7	In-gel Trypsin digest
DTT	Sigma-Aldrich	D0632-1G	In-gel Trypsin digest
Formic Acid	Sigma-Aldrich	F0507-500ML	In-gel Trypsin digest
HPLC grade H2O	Sigma-Aldrich	270733-4L	In-gel Trypsin digest
Iodoacetamide	Bio Basic	144-48-9	In-gel Trypsin digest
Trypsin	Promega	V5111	In-gel Trypsin digest
Protein LoBind Tube 1.5ml	Eppendorf	22431081	In-gel Trypsin digest
2mL ROBO vial 9mm	Candian Life Science	VT009/C395SB	In-gel Trypsin digest
PP BM insert, No spring	Candian Life Science	4025P-631	In-gel Trypsin digest