Een Aquatic Microbial MetaProteomics Workflow: Van cellen tot Tryptic Peptiden geschikt voor Tandem massaspectrometrie-gebaseerde Analyse

Summary

This protocol is for the extraction and concentration of protein and DNA from microbial biomass collected from seawater, followed by the generation of tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based proteomic analysis.

Abstract

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and metabolism. Although powerful, metagenomics alone can only elucidate functional potential. On the other hand, metaproteomics enables the description of the expressed in situ metabolism and function of a community. Here we describe a protocol for cell lysis, protein and DNA isolation, as well as peptide digestion and extraction from marine microbial cells collected on a cartridge filter unit (such as the Sterivex filter unit) and preserved in an RNA stabilization solution (like RNAlater). In mass spectrometry-based proteomics studies, the identification of peptides and proteins is performed by comparing peptide tandem mass spectra to a database of translated nucleotide sequences. Including the metagenome of a sample in the search database increases the number of peptides and proteins that can be identified from the mass spectra. Hence, in this protocol DNA is isolated from the same filter, which can be used subsequently for metagenomic analysis.

Introduction

Micro-organismen zijn alomtegenwoordig en spelen een essentiële rol in de aarde biogeochemische cycli ^1. Momenteel zijn er tal van moleculaire benaderingen beschikbaar voor het karakteriseren van microbiële gemeenschappen structuur en functie. Meestal wordt de analyse van 16S rRNA gensequenties PCR-geamplificeerd van milieu DNA ^{2 – 4.} Een nadeel van 16S rRNA gen analyse is dat het alleen informatie over de identiteit en fylogenetische Gemeenschapsstructuur weinig informatie over metabolische functie. In tegenstelling, benaderingen zoals metagenomica, transcriptoomstudie en MetaProteomics geven informatie over de gemeenschap structuur en de stofwisseling. Metagenomica, of de analyse van het gen inhoud van een verzameling van organismen, geeft informatie over de structuur en de functionele mogelijkheden van de gemeenschap ^5-8. Hoewel krachtig kan deze functionele potentie niet overeenstemmen met de metabolischeactiviteiten van organismen. Genotype van een organisme wordt vertegenwoordigd door de genen, die elk kunnen worden getranscribeerd naar RNA en verder vertaald naar eiwit, wat resulteert in een fenotype. Dus, om te helpen bij het ​​begrijpen van microbiële functionele activiteit in een omgeving moet postgenomische analyse uitgevoerd ^9. Transcriptoomstudie of de analyse van RNA-transcripten is nuttig omdat het toont welke genen worden getranscribeerd in een bepaalde omgeving. Echter, mRNA niet altijd overeenkomen met hun overeenkomstige proteïne verhogen door translationele regulering, RNA halfwaardetijd, en het feit dat meerdere kopieën eiwit kan worden gegenereerd voor iedere ¹⁰ mRNA.

Om deze redenen MetaProteomics wordt nu erkend als een belangrijk instrument voor het milieu microbiologie. Gemeenschappelijke metaproteomic analyseert gebruik een shotgun proteomics aanpak waar de buurt volledige aanvulling van eiwitten in een complex monster worden gezuiverd en tegelijkertijd geanalyseerd, meestal door middel van een eigenzymatic spijsvertering in peptiden en analyses over een massaspectrometer. Daaropvolgende tandem massaspectrometrie (MS / MS) "peptide fingerprinting" wordt gebruikt om de peptidesequentie en potentiële eiwit van oorsprong door proteïne-database zoeken (zie voor een overzicht ¹¹⁾ te bepalen. Proteomics werk heeft een lange weg afgelegd in de afgelopen 25 jaar, dankzij de stijging van de genomische beschikbaarheid van gegevens en de toename van de gevoeligheid en de nauwkeurigheid van massaspectrometers waardoor high-throughput identificatie en kwantificatie ^11,12 eiwit. Aangezien eiwitten zijn het eindproduct van genexpressie, kan metaproteomic gegevens te bepalen welke organismen actief zijn in een bepaalde omgeving en welke eiwitten ze tot expressie zijn. Dit is voordelig wanneer het proberen om te bepalen hoe een bepaalde set van omgevingsvariabelen het fenotype van een organisme of de gemeenschap zal beïnvloeden. Vroeg, MS / MS-gebaseerde metaproteomic studies in de oceaan werden gebruikt om specifieke eiwitten te identificeren in gerichtemicrobiële lineages, eerste studie gericht op het licht aangedreven proton pomp proteorhodopsin in SAR11 mariene bacteriën ^13. Recenter zijn vergelijkende analyses metaproteomic differentiële eiwit expressiepatronen tussen gemeenschappen die toegelicht. Voorbeelden zijn onder meer de identificatie van temporele verschuivingen in de stofwisseling in de kust Noordwest-Atlantische Oceaan ^{14 of} het Antarctisch Schiereiland ^5. Andere studies hebben veranderingen beschreven in eiwitexpressie patronen in ruimtelijke schalen, bijvoorbeeld langs een geografisch transect een lage nutriënt ocean wervel een hoogproductieve kust opwelling systeem ^15. Voor verdere beoordelingen van MetaProteomics raden wij Schneider et al. (2010) ^{9 en} Williams et al. (2014) ^16. Gerichte proteomics is ook werkzaam in de afgelopen jaren expressie van specifieke metabole pathways kwantificeren milieu ^17,18.

There zijn drie belangrijke fasen in metaproteomic analyse. De eerste fase is monstervoorbereiding die monsterneming, cellysis en concentratie van eiwit bevat. Monsterverzameling in mariene microbiologie leidt vaak filtratie van zeewater door een voorfilter grotere eukaryotische cellen, deeltjes en deeltjes geassocieerde bacteriën te verwijderen, gevolgd door filtreren voor het afvangen van vrij levende microbiële cellen, gewoonlijk met behulp van een 0,22 um cartridge filterinstallatie ^19,20. Deze filters zijn ingegoten in een kunststof cilinder en een cellyse en eiwit-extractie protocol dat binnen de filtereenheid kan worden uitgevoerd, kunnen een waardevol instrument zijn. Zodra biomassa wordt verkregen, moeten de cellen worden gelyseerd om voor eiwitextractie. Verschillende werkwijzen kunnen worden toegepast, zoals guanidine-HCl lysis ²¹ en natriumdodecylsulfaat (SDS) lysis gebaseerde methoden. Hoewel wasmiddelen als SDS zijn zeer efficiënt bij het verstoren van membranen en het oplosbaar maken vele soorten eiwitten, concentratiONS zo laag als 0,1% kunnen interfereren met stroomafwaartse eiwit vertering en MS-analyse ^22. Van groot belang is de negatieve effecten van SDS voor trypsinedigestie efficiency, oplossend vermogen van omgekeerde fase vloeistofchromatografie en ion onderdrukking of accumulatie in de ionenbron ^23.

De tweede fase fractionering en analyse, waarbij eiwitten worden onderworpen aan enzymatische digestie gevolgd door LC MS / MS analyse, waardoor am / z fragmentatiepatroon die kunnen worden gebruikt voor de primaire aminozuursequentie van het tryptische peptide initiële bepalen. Verschillende digestiemethoden kunnen worden gebruikt afhankelijk van de soorten reinigingsmiddelen gebruikt, evenals de stroomafwaartse massaspectrometrie workflow. In het protocol wordt 1-D PAGE elektroforese, gevolgd door verwijdering van SDS uit de gel gebruikt om eventuele verontreinigingen te verwijderen detergens. De analyse van eiwitten moeilijk oplosbaar, zoals membraaneiwitten zijn, vereist het gebruik van hoge concentraties van SDS of andere schoonmaakmiddelen. Dit leidt tot compatibiliteitsproblemen met SDS-gelelektroforese. Wanneer het doel van onderzoek vereist het oplossen van deze harde eiwitten oplosbaar te maken, kan de buis-gelsysteem gebruikt ^22,24. De buis-gel methode omvat eiwitten in de gel matrix zonder het gebruik van elektroforese. Vervolgens elke reinigingsmiddelen gebruikt voor het oplosbaar zijn voor de vertering van eiwitten verwijderd.

De derde fase is de bio-informatica-analyse. In deze fase worden de MS / MS peptide data doorzocht tegen een databank van vertaald nucleotidesequenties te bepalen welke peptiden en proteïnen in het monster aanwezig zijn. De identificatie van peptiden is afhankelijk van de databank wordt doorzocht tegen. Marine metaproteomic gegevens worden vaak gezocht tegen databases bestaat uit referentie genomen, metagenomic gegevens zoals het Global Ocean Sampling dataset ^25, evenals enkele cel versterkt genomen uit onontgonnen lineages ^26,27. Eiwit identificatie kan ook worden verhoogd door het opnemen van metagenomic sequenties van hetzelfde monster als metaproteomic data afkomstig ^5.

Hier geven we een protocol voor het genereren van peptiden die geschikt zijn voor MS / MS-gebaseerde analyse van microbiële biomassa door filtratie verzameld en opgeslagen in een RNA stabilisatie oplossing. De hier beschreven protocol zorgt voor DNA en eiwitten te worden geïsoleerd van hetzelfde monster, zodat alle stappen in de aanloop naar het eiwit en DNA neerslag zijn identiek. Vanuit praktisch oogpunt, minder filtering nodig omdat slechts één filter is vereist voor zowel eiwit- en DNA-extractie. We willen ook graag om te erkennen dat dit protocol werd gecreëerd door de combinatie, aanpassing en wijziging van de twee eerder gepubliceerde protocollen. De cellysis stappen worden aangepast van Saito et al. (2011) ²⁸ en de in-gel trypsinedigest component wordt aangepast van ShevcheNKO et al. (2007) ^29.

Protocol

1. Bereid reagentia Bereid SDS-extractie-oplossing: 0,1 M Tris-HCl pH 7,5, 5% glycerol, 10 mM EDTA en 1% SDS. Filter-steriliseren met behulp van een 0,22 um filter en bewaar bij 4 ° C. Bereid voorraad reagentia die nodig zijn voor de polyacrylamidegel. Bereid 1,5 M Tris-HCl pH 8,8. Filter-steriliseren met behulp van een 0,22 pm filter en bewaar bij kamertemperatuur. 0,5 M Tris-HCl pH 6,8. Filter-steriliseren met behulp van een 0,22 pm filter en bewaar bij kamertemperatuur. <…

Representative Results

Als een demonstratie, voerden we het protocol over twee zeewater monsters van het oppervlak en de chlorofyl maximum van de kust oceaan in Noord-Canada. Op zee, 6-7 liter zeewater werd door een 3 urn GF / D prefilter, dan microbiële cellen werden verzameld op een 0,22 urn filter cartridge apparaat volgens het protocol van Walsh et al. 20. Cellen werden onmiddellijk opgeslagen in een RNA-stabilisatie oplossing totdat verdere verwerking. Bij terugkeer naar het lab, voerden we het protocol zoals het hie…

Discussion

Monster behoud is de sleutel tot metaproteomic studies en eerdere werk heeft aangetoond dat een RNA stabilisatie oplossing is een handig opslag buffer voor het opslaan van de cellen voorafgaand aan eiwitextractie ^28. Idealiter zouden de monsters worden geconserveerd in situ verschuivingen in eiwitexpressie teniet tijdens hantering ^33,34. In feite, in situ sampling en fixatie technologieën ontwikkeld, waarmee de autonome verzamelen en bewaren van monsters per schip ingezet instrum…

Materials

Sterivex -GP 0.22 μm filter unit	Millipore	SVGP01050	Sampling
RNAlater Stabilization Solution	Ambion	AM7021	Sampling
Tris	Bio Basic	77-86-1 or TB0196-500G	Protein Extraction/ SDS PAGE gel
DTT	Sigma-Aldrich	D0632-1G	Protein Extraction
SDS	Bio Basic	15-21-3	Protein Extraction/ SDS PAGE gel
EDTA	Bio Basic	6381-92-6	Protein Extraction
Glycerol	Fisher Scientific	56-81-5	Protein Extraction
10K Amicon Filter	Millipore	UFC801024	Protein Extraction
Methanol	Sigma-Aldrich	179337-4L	Protein Precipitation
Acetone	Fisher Scientific	67-64-1	Protein Precipitation
MPC Protein Precipitation reagent	Epicenter	mmP03750	DNA Precipitation
2-Propanol	Fisher Scientific	67-63-0	DNA Precipitation
Qubit dsDNA BR Assay kit	Life Technologies	Q32850	DNA Quantification
Qubit Protein Assay kit	Life Technologies	Q33211	Protein Quantification
Sucrose	Bio Basic	57-50-1	SDS PAGE gel
TEMED	Bio Rad	161-0800	SDS PAGE gel
APS	Bio Rad	161-0700	SDS PAGE gel
30% Acrylamide	Bio Rad	161-0158	SDS PAGE gel
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060	SDS PAGE gel
Glycine	Bio Rad	161-0718	SDS PAGE gel
B-mercaptoethanol	Bio Basic	60-24-2	SDS PAGE gel
Laemmli Sample Buffer	Bio Rad	161-0737	SDS PAGE gel
Precision Plus Protein Kaleidoscope Ladder	Bio Rad	161-0375EDU	SDS PAGE gel
Acetonitrile	VWR	CABDH6044-4	In-gel Trypsin digest
NH4HCO3	Bio Basic	1066-33-7	In-gel Trypsin digest
DTT	Sigma-Aldrich	D0632-1G	In-gel Trypsin digest
Formic Acid	Sigma-Aldrich	F0507-500ML	In-gel Trypsin digest
HPLC grade H2O	Sigma-Aldrich	270733-4L	In-gel Trypsin digest
Iodoacetamide	Bio Basic	144-48-9	In-gel Trypsin digest
Trypsin	Promega	V5111	In-gel Trypsin digest
Protein LoBind Tube 1.5ml	Eppendorf	22431081	In-gel Trypsin digest
2mL ROBO vial 9mm	Candian Life Science	VT009/C395SB	In-gel Trypsin digest
PP BM insert, No spring	Candian Life Science	4025P-631	In-gel Trypsin digest