수생 미생물 Metaproteomics 워크 플로우 : 탠덤 질량 분석 기반 분석에 적합 트립신 펩티드로 세포
Summary
This protocol is for the extraction and concentration of protein and DNA from microbial biomass collected from seawater, followed by the generation of tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based proteomic analysis.
Abstract
Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and metabolism. Although powerful, metagenomics alone can only elucidate functional potential. On the other hand, metaproteomics enables the description of the expressed in situ metabolism and function of a community. Here we describe a protocol for cell lysis, protein and DNA isolation, as well as peptide digestion and extraction from marine microbial cells collected on a cartridge filter unit (such as the Sterivex filter unit) and preserved in an RNA stabilization solution (like RNAlater). In mass spectrometry-based proteomics studies, the identification of peptides and proteins is performed by comparing peptide tandem mass spectra to a database of translated nucleotide sequences. Including the metagenome of a sample in the search database increases the number of peptides and proteins that can be identified from the mass spectra. Hence, in this protocol DNA is isolated from the same filter, which can be used subsequently for metagenomic analysis.
Introduction
미생물은 유비쿼터스하고 지구의 생물 지구 화학 사이클 1에 필수적인 역할을한다. 현재, 미생물 군집의 구조와 기능을 특성화 할 수 많은 분자 접근 방법이있다. 4 – 일반적인 16S rRNA 유전자 분석 환경 (2)로부터 DNA가 PCR 증폭 된 서열이다. 16S rRNA 유전자 분석의 단점은 대사 기능 만에 거의 정보, 계통 신원 및 커뮤니티 구조에 대한 정보를 제공한다는 것이다. 메타 지노믹스, metatranscriptomics 및 metaproteomics은 사회 구조와 대사에 대한 정보를 제공하기 때문에 대조적으로, 이러한 접근한다. 8 – 메타 지노믹스, 또는 생물의 유전자 군집의 함유량의 분석은, 커뮤니티 5의 구조 및 기능적 가능성에 대한 정보를 제공한다. 강력한 있지만,이 기능은 대사 전위에 대응하지 않을 수도생물의 활동. 유기체의 유전자형은 RNA로 전사 또한 표현형의 결과, 단백질로 번역 될 수있는 각각의 유전자에 의해 표현된다. 따라서, 환경에서 미생물 활성 작용의 이해를 돕기 위해, 포스트 게놈 분석 9를 수행한다. 그것은 주어진 환경에서 전사되는 유전자 밝혀 때문에 Metatranscriptomics, 또는 RNA 전 사체의 분석에 유용합니다. 그러나 mRNA 수준은 항상 인해 병진 규제 RNA 반감기, 다중 단백질의 mRNA는 모든 사본 (10)에 대해 생성 될 수 있다는 사실에 해당 단백질 수준과 일치하지 않는다.
이러한 이유 metaproteomics 지금 환경 미생물학을위한 중요한 도구로 인식되고있다. 일반 metaproteomic은 복잡한 시료에서 단백질의 가까운 완벽하게 보완 보통 EN을 통해 정제 동시에 분석 산탄 총 프로테오믹스 방법을 사용 분석질량 분석기에서 펩타이드 및 분석에 zymatic 소화. 후속 탠덤 질량 분석 (MS / MS) "펩타이드 지문은"검색 단백질 데이터베이스에서 단백질 서열과 기원의 잠재적 인 단백질 (검토를 위해 11 참조)를 결정하는 데 사용됩니다. 단백체 연구는 게놈 데이터 가용성의 증가 및 민감도와 높은 처리량 단백질 식별 및 정량 (11, 12)을 허용 질량 분석기의 정확도의 증가로 지난 25 년 덕분에 먼 길을왔다. 단백질은 유전자 발현의 최종 제품이기 때문에, metaproteomic 데이터는 주어진 환경과 어떤 단백질들이 표현되어에서 활동하는 유기체를 결정하는 데 도움이됩니다. 환경 변수들의 특정 세트는 유기체 또는 커뮤니티의 표현형에 미치는 영향을 결정하기 위해 시도 할 때 유리하다. 초기에, 바다에서 MS / MS 기반 metaproteomic 연구 대상의 특정 단백질을 식별하는 데 사용되었다SAR11 해양 박테리아 (13)의 빛 구동 양성자 펌프 proteorhodopsin에 초점을 맞춘 첫 번째 연구와 미생물 계통. 최근 metaproteomic 비교 분석 복잡한 공동체 간의 차등 단백질 발현 패턴을 규명 하였다. 예를 들면 연안 북서부 대서양 14 남극 반도 5 대사의 시간적 변화의 식별을 포함한다. 다른 연구는 생산성이 높은 연안 용승 시스템 (15)에 저 영양 해양 환류에서 지리적 가로로 쪼개다 따라, 예를 들어, 공간 규모에 걸쳐 단백질 발현 패턴의 변화를 설명했다. metaproteomics의 자세한 리뷰를 위해 우리는 슈나이더 외. (2010) 9 윌리엄스 외. (2014) 16 좋습니다. 표적 단백질 체학은 또한 환경 (17, 18)의 특정 대사 경로의 발현을 정량하기 위해 최근 사용되어왔다.
THERmetaproteomic 분석의 세 가지 주요 단계는 전자 있습니다. 첫 번째 단계는 샘플 수집, 세포 용해 단백질의 농도를 포함하는 샘플을 준비한다. 해양 미생물의 시료 채취는 대개 일반적으로 0.22 ㎛의 카트리지를 사용하여, 자유 살아있는 미생물 세포의 포착을 위해 여과 하였다 큰 진핵 세포, 입자 및 입자 – 관련 박테리아를 제거하는 프리 필터를 통해 해수를 여과 수반 필터 유닛 (19, 20). 이러한 필터는 플라스틱 실린더 incased하고 필터 부 내에서 수행 될 수있다 세포 용해 단백질 추출 프로토콜은 유용한 도구가 될 것이다. 바이오 매스가 얻어지면, 세포 단백질 추출을 위해 용해 될 수 있도록한다. 여러 방법이 구아니딘 염산 용해 21 및 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS) 기반 분해 방법을 포함하여, 또한 사용될 수있다. SDS와 같은 세정제, concentrati 많은 단백질 유형을 파괴하고 세포막을 가용화에 매우 효율적이지만0.1 %가 하류 단백질 소화와 MS 분석 (22)을 방해 할 수있는만큼 낮은 기능. 주요 관심사의 이온 소스 (23) 내부의 역상 액체 크로마토 그래피와 이온의 축적 억제 또는 해상력, 트립신 소화 효율에 SDS의 부정적인 효과이다.
두 번째 단계는 단백질 초기 트립신 펩티드의 1 차 아미노산 서열을 확인하는 데 사용할 수있는 AM / z 단편화 패턴의 결과로 LC MS / MS 분석 하였다 효소 소화 받는다 분류 및 분석한다. 다양한 소화 방법이 사용될 세제의 종류뿐만 아니라 질량 분광법 하류 흐름에 따라 수행 될 수있다. 우리의 프로토콜에서, SDS 겔로부터 제거하여 1-D의 PAGE 전기 영동 세제 오염을 제거하기 위해 이용된다. 이러한 막 단백질로서, 용해하기 어려운 단백질의 분석은, 높은 concen의 사용을 필요SDS 또는 다른 세제의 trations. 이는 SDS 겔 전기 영동과의 호환성 문제로 이끈다. 연구의 목적은 단백질을 용해하기 어려운 이들의 가용화가 필요한 경우, 관 – 겔 시스템 (22, 24)을 사용할 수있다. 튜브 – 겔법은 전기를 사용하지 않고 겔 매트릭스 내의 단백질을 포함한다. 그 후 가용화에 사용되는 모든 세제는 단백질 소화하기 전에 제거됩니다.
세 번째 단계는 생물 정보학 분석이다. 이 단계에서 MS / MS 데이터 펩티드는 펩티드 및 단백질 시료에 존재하는 결정으로 변환 뉴클레오티드 서열의 데이터베이스에 대해 검색된다. 펩타이드의 동정은 대하여 검색되는 데이터베이스에 의존한다. 해양 metaproteomic 데이터는 일반적으로 참조 게놈, 이러한 글로벌 오션 샘플링 데이터 세트 25 metagenomic 데이터뿐만 아니라 경작 리에서 단일 세포 증폭 된 게놈 구성 데이터베이스에 대해 검색됩니다(26, 27)를 neages. metaproteomic 데이터 5를 도출되었을 단백질 식별은 또한 동일한 샘플로부터 metagenomic 서열의 포함으로 증가시킬 수있다.
여기서 우리는 미생물 바이오 매스로부터 MS / MS 기반 분석에 적합한 펩티드를 여과 수집하고 RNA 안정화 용액에 기억의 생성을위한 프로토콜을 제공한다. 여기에 설명 된 프로토콜은 DNA와 단백질이 모든 단계가 단백질로 이어지는 및 DNA의 침전이 동일 그래서 동일한 샘플에서 고립 될 수 있습니다. 단지 하나의 필터는 단백질 및 DNA 추출 둘 필요가 있기 때문에 실용적 관점에서, 적은 여과가 필요하다. 우리는 또한이 프로토콜이 이전에 발행 된 프로토콜의 조합, 적응 및 수정을 통해 만들어진 것을 인정하고 싶습니다. 세포 용해 단계 (2011) 28. 사이토 등의 알에서 적응하고 구성 요소를 소화에 – 겔 트립신은 Shevche에서 적응NKO 등. (2007) 29.
Protocol
Representative Results
Discussion
샘플 보존 metaproteomic 연구에 중요하다 이전 작업은 RNA 안정화 용액 전에 단백질 추출 (28)에 셀을 저장하는 저장 버퍼 유용한 것으로 입증 하였다. 이상적으로, 샘플은 33, 34를 처리하는 동안 단백질 발현의 변화를 부정하는 현장에 보존 될 것이다. 사실, 시츄 샘플링 및 고정 기술은 선박 배치 인스트루먼트 자율 수집 및 샘플의 보존을 허용하는 개발되었다. 그러나, ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Marcos Di Falco for his expertise and advice with the preparation of the samples for nano-LC MS/MS as well as Dr. Zoran Minic from the University of Regina for the LC MS/MS analysis. This work was supported by NSERC (DG402214-2011) and CRC (950-221184) funding. D.C. was supported by Concordia Institute for Water, Energy, and Sustainable Systems and FQRNT.
Materials
| Sterivex -GP 0.22 μm filter unit | Millipore | SVGP01050 | Sampling |
| RNAlater Stabilization Solution | Ambion | AM7021 | Sampling |
| Tris | Bio Basic | 77-86-1 or TB0196-500G | Protein Extraction/ SDS PAGE gel |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632-1G | Protein Extraction |
| SDS | Bio Basic | 15-21-3 | Protein Extraction/ SDS PAGE gel |
| EDTA | Bio Basic | 6381-92-6 | Protein Extraction |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | Protein Extraction |
| 10K Amicon Filter | Millipore | UFC801024 | Protein Extraction |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-4L | Protein Precipitation |
| Acetone | Fisher Scientific | 67-64-1 | Protein Precipitation |
| MPC Protein Precipitation reagent | Epicenter | mmP03750 | DNA Precipitation |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | 67-63-0 | DNA Precipitation |
| Qubit dsDNA BR Assay kit | Life Technologies | Q32850 | DNA Quantification |
| Qubit Protein Assay kit | Life Technologies | Q33211 | Protein Quantification |
| Sucrose | Bio Basic | 57-50-1 | SDS PAGE gel |
| TEMED | Bio Rad | 161-0800 | SDS PAGE gel |
| APS | Bio Rad | 161-0700 | SDS PAGE gel |
| 30% Acrylamide | Bio Rad | 161-0158 | SDS PAGE gel |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | SDS PAGE gel |
| Glycine | Bio Rad | 161-0718 | SDS PAGE gel |
| B-mercaptoethanol | Bio Basic | 60-24-2 | SDS PAGE gel |
| Laemmli Sample Buffer | Bio Rad | 161-0737 | SDS PAGE gel |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Ladder | Bio Rad | 161-0375EDU | SDS PAGE gel |
| Acetonitrile | VWR | CABDH6044-4 | In-gel Trypsin digest |
| NH4HCO3 | Bio Basic | 1066-33-7 | In-gel Trypsin digest |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632-1G | In-gel Trypsin digest |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | F0507-500ML | In-gel Trypsin digest |
| HPLC grade H2O | Sigma-Aldrich | 270733-4L | In-gel Trypsin digest |
| Iodoacetamide | Bio Basic | 144-48-9 | In-gel Trypsin digest |
| Trypsin | Promega | V5111 | In-gel Trypsin digest |
| Protein LoBind Tube 1.5ml | Eppendorf | 22431081 | In-gel Trypsin digest |
| 2mL ROBO vial 9mm | Candian Life Science | VT009/C395SB | In-gel Trypsin digest |
| PP BM insert, No spring | Candian Life Science | 4025P-631 | In-gel Trypsin digest |
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