Ein Aquatic Microbial Metaproteomik Workflow: Von der Zelle zum tryptischen Peptide Geeignet für Tandem-Massenspektrometrie-basierte Analyse

Summary

This protocol is for the extraction and concentration of protein and DNA from microbial biomass collected from seawater, followed by the generation of tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based proteomic analysis.

Abstract

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and metabolism. Although powerful, metagenomics alone can only elucidate functional potential. On the other hand, metaproteomics enables the description of the expressed in situ metabolism and function of a community. Here we describe a protocol for cell lysis, protein and DNA isolation, as well as peptide digestion and extraction from marine microbial cells collected on a cartridge filter unit (such as the Sterivex filter unit) and preserved in an RNA stabilization solution (like RNAlater). In mass spectrometry-based proteomics studies, the identification of peptides and proteins is performed by comparing peptide tandem mass spectra to a database of translated nucleotide sequences. Including the metagenome of a sample in the search database increases the number of peptides and proteins that can be identified from the mass spectra. Hence, in this protocol DNA is isolated from the same filter, which can be used subsequently for metagenomic analysis.

Introduction

Mikroorganismen sind allgegenwärtig und spielen eine essentielle Rolle in der Erde biogeochemischen Kreisläufen ^1. Derzeit gibt es zahlreiche Ansätze zur Charakterisierung von molekularen mikrobiellen Gemeinschaft Struktur und Funktion zur Verfügung. Am häufigsten ist die Analyse der 16S-rRNA-Gensequenzen aus Umwelt-DNA ² PCR-amplifizierte ^{– 4.} Ein Nachteil des 16S-rRNA-Gen-Analyse ist, dass es nur gibt Auskunft über phylogenetische Identität und Gemeinschaftsstruktur, mit wenig Informationen über die Stoffwechselfunktion. Im Gegensatz dazu Ansätze wie Metagenomik, metatranscriptomics und Metaproteomik Informationen über Community-Struktur und den Stoffwechsel. Metagenomik, oder die Analyse der Gen-Gehalt von einer Ansammlung von Organismen, bietet Informationen über die Struktur und funktionelle Potential der Community ^5-8. Obwohl stark, kann dies Funktionspotenzial nicht auf die Stoffwechsel entsprechenAktivitäten der Organismen. Eines Organismus Genotyp von den Genen, von denen jeder zu RNA transkribiert werden und weiter zu Protein translatiert wird, was zu einem Phänotyp repräsentiert. Somit, um das Verständnis der mikrobiellen funktionelle Aktivität in einer Umgebung zu unterstützen, sollte postgenomische Analyse durchgeführt ⁹ werden. Metatranscriptomics oder die Analyse von RNA-Transkripten ist nützlich, weil es zeigt, welche Gene in einer bestimmten Umgebung transkribiert werden. Jedoch mRNA-Niveaus nicht immer ihre entsprechenden Proteinniveaus entsprechen aufgrund Translationsregulation, RNA-Halbwertszeit und der Tatsache, dass Mehrfachkopien-Protein kann für jede mRNA ¹⁰ erzeugt werden.

Aus diesen Gründen Metaproteomik wird jetzt als ein wichtiges Instrument zur Umweltmikrobiologie anerkannt. Gemeinsame metaproteomic Analysen verwenden eine Schrotflinte Proteomics Ansatz, wo die in der Nähe vollen Ergänzung der Proteine, die in einer komplexen Probe werden in der Regel durch en gereinigt und gleichzeitig analysiert,enzymatische Verdauung in Peptide und Analysen zu einem Massenspektrometer. Nachfolgende Tandem-Massenspektrometrie (MS / MS) "Peptid-Fingerprinting" wird verwendet, um die Peptidsequenz und potentiellen Proteinherkunfts durch Proteindatenbanksuche (für eine Übersicht siehe ¹¹⁾ zu bestimmen. Proteom-Arbeit hat einen langen Weg in den letzten 25 Jahren dank der Zunahme der genomischen Datenverfügbarkeit und der Erhöhung der Empfindlichkeit und Genauigkeit von Massenspektrometern so dass für Hochdurchsatz-Protein Identifizierung und Quantifizierung ^11,12 kommen. Da Proteine ​​sind das Endprodukt der Genexpression kann metaproteomic Daten helfen, festzustellen, welche Organismen in einem bestimmten Umfeld und welche Proteine ​​sie ausdrücken aktiv sind. Dies ist vorteilhaft, wenn versucht wird, zu bestimmen, wie ein bestimmter Satz von Umgebungsvariablen den Phänotyp des Organismus oder Gemeinde betreffen. Schon früh, MS / MS-basierte metaproteomic Studien im Ozean wurden verwendet, um spezifische Proteine ​​gezielt zu identifizierenmikrobielle Abstammungslinien, wobei die erste Studie über die Licht angetrieben Protonenpumpen Proteorhodopsin in SAR11 Meeresbakterien ^13. In jüngerer Zeit wurden vergleichende Analysen metaproteomic differentiellen Proteinexpressionsmuster zwischen komplexen Gemeinschaften erläutert. Beispiele hierfür sind die Identifizierung von zeitlichen Verschiebungen im Stoffwechsel in der Küsten Nordwest-Atlantik ^{14 oder} der Antarktischen Halbinsel ^5. Andere Studien haben Schwankungen der Proteinexpressionsmuster auf räumlichen Skalen von einem nährstoffarmen Ozean gyre zu einer hoch produktiven ^{Küstenauftriebssystem} 15 beschrieben, zum Beispiel entlang einer geographischen Transekt. Für weitere Bewertungen von Metaproteomik empfehlen wir Schneider et al. (2010) ^{9 und} Williams et al. (2014) ^16. Gezielte Proteomik ist in den letzten Jahren verwendet worden, um die Expression von spezifischen Stoffwechselwege in die Umgebung ^17,18 quantifizieren.

There sind drei Hauptphasen in metaproteomic Analyse. Die erste Phase ist die Probenvorbereitung, die Probenentnahme, die Zelllyse und die Konzentration des Proteins umfasst. Probensammlung in Marine Mikrobiologie häufig mit der Filtration von Meerwasser durch einen Vorfilter zu größeren eukaryotischen Zellen, Partikel und Partikel-assoziierten Bakterien zu entfernen, gefolgt von Filtration, für die Abscheidung von frei lebenden Mikrobenzellen, die üblicherweise mit der Verwendung eines 0,22 um Patrone Filtereinheit ^19,20. Diese Filter werden in einem Plastikzylinder hüllt und eine Zelllyse und Proteinextraktionsprotokoll, das innerhalb der Filtereinheit durchgeführt werden kann, wäre ein wertvolles Werkzeug ist. Einmal Biomasse erhalten wird, müssen die Zellen lysiert werden, um die Proteinextraktion zu ermöglichen. Mehrere Verfahren können verwendet werden, einschließlich Guanidin-HCl-Lyse ²¹ und Natriumdodecylsulfat (SDS) basierte Lyseverfahren. Obwohl Detergenzien wie SDS sind sehr effizient bei stören Membranen und Solubilisieren vielen Proteinarten, concentrations von nur 0,1% kann mit nachgeschalteten Proteinverdauung und MS-Analyse ²² stören. Wichtiges Anliegen ist die negative Wirkung von SDS auf Trypsinverdau Effizienz, Auflösungsvermögen von Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie und Ionensuppression oder Ansammlung innerhalb der ^Ionenquelle 23.

Die zweite Phase ist die Fraktionierung und Analyse, wo Proteine ​​einer enzymatischen Verdauung, gefolgt von LC MS / MS-Analyse unterzogen, was zu einer m / z-Fragmentierungsmuster, das verwendet werden kann, um die primäre Aminosäuresequenz des ursprünglichen tryptischen Peptids festzustellen. In Abhängigkeit von den Arten von Waschmitteln, sowie die nachgeschaltete Massenspektrometrie Workflow verschiedene Aufschlußmethoden durchgeführt werden. In unserem Protokoll wird 1-D-PAGE-Elektrophorese, gefolgt von Entfernung von SDS aus dem Gel, um jegliche Verunreinigungen zu entfernen Detergens verwendet wird. Die Analyse von Proteinen, die schwer zu solubilisieren, wie Membranproteine ​​sind, erfordert die Verwendung von hohen Konzentrationen von SDS oder andere Reinigungsmittel. Dies führt zu Kompatibilitätsprobleme mit SDS-Gelelektrophorese. Wenn das Ziel einer Studie erfordert die Solubilisierung dieser schwer Proteine ​​löslich, kann das Rohr-Gel-System verwendet werden ^22,24. Das Rohr-Gel-Verfahren enthält Proteine ​​innerhalb der Gel-Matrix ohne die Verwendung von Elektrophorese. Anschließend jegliche Detergenzien zur Solubilisierung verwendet werden, bevor die Proteinverdauung entfernt.

Die dritte Phase ist die Bioinformatik-Analyse. In dieser Phase werden die MS / MS Peptid Daten werden mit einer Datenbank von setzten Nukleotidsequenzen durchsucht, um festzustellen, welche Peptide und Proteine ​​in der Probe vorhanden sind. Die Identifizierung von Peptiden ist von der Datenbank gegen gesucht. Meeres metaproteomic Daten werden häufig gegen Datenbanken von Referenzgenome, Metagenom-Daten wie die Global Ocean Sampling-Datensatz ^25, ebenso wie einzelne Zelle verstärkt Genome von unkultivierten li umfasst gesuchtneages ^26,27. Proteinidentifikation kann auch durch den Einschluss von metagenomic Sequenzen aus der gleichen Probe erhöht, wenn der metaproteomic Daten wurden ⁵ abgeleitet werden.

Hier stellen wir ein Protokoll für die Erzeugung von Peptiden geeignet für MS / MS-basierte Analyse von mikrobiellen Biomasse durch Filtration gesammelt und in einem RNA-Stabilisierungslösung gelagert. Das hier beschriebene Protokoll erlaubt DNA und Protein, von der gleichen Probe, so dass alle Schritte, die zu dem Protein und DNA Fällungen identisch sind, isoliert werden. Aus praktischer Sicht wird weniger Filtration erforderlich, da nur ein Filter ist sowohl für Protein und DNA-Extraktion erforderlich. Wir möchten auch, um zu bestätigen, dass dieses Protokoll wurde durch die Kombination, die Anpassung und Änderung von zwei bisher veröffentlichten Protokollen erstellt. Zelllysis Schritte von Saito et al (2011) ²⁸ angepasst. Und die In-Gel-Trypsin-Verdauung Komponente aus Shevche angepaßtNKO et al. ⁽²⁰⁰⁷⁾ 29.

Protocol

1. Bereiten Reagenzien Vorbereitung SDS-Extraktionslösung: 0,1 M Tris-HCl pH 7,5, 5% Glycerin, 10 mM EDTA und 1% SDS. Filter-Sterilisation mit einem 0,22 um Filter und bei 4 ° C. Bereiten stock Reagenzien für die Polyacrylamid-Gel nötig. Bereiten 1,5 M Tris-HCl pH 8,8. Filter-Sterilisation mit einem 0,22 um Filter und bei Raumtemperatur lagern. 0,5 M Tris-HCL pH 6,8. Filter-Sterilisation mit einem 0,22 um Filter und bei Raumtemperatur lagern. Bereiten Sie 10% SDS. Fi…

Representative Results

Als Demonstration, das Protokoll führten wir auf zwei Meerwasserproben von der Oberfläche und der Chlorophyllmaximum des Küsten Ozean in Nord-Kanada gesammelt. Auf See wurde 6-7 L des Meerwassers durch eine 3 & mgr; GF / D-Vorfilter geleitet, dann mikrobiellen Zellen wurden auf eine 0,22 um-Patronenfiltergerät nach dem Protokoll von Walsh et al. 20 gesammelt. Zellen wurden sofort in einem RNA-Stabilisierungslösung bis zur weiteren Verarbeitung gelagert. Nach der Rückkehr in das Labor, das P…

Discussion

Probenkonservierung ist der Schlüssel zur metaproteomic Studien und früheren Arbeiten gezeigt, dass ein RNA-Stabilisierungslösung ist eine nützliche Speicherpuffer zum Speichern von Zellen vor der Proteinextraktion ^28. Idealerweise würden Proben in situ erhalten werden, um Verschiebungen in der Protein-Expression während der Handhabung ^33,34 negieren. In der Tat, in situ Probenahme und Fixierungstechniken sind entwickelt worden, die für die autonome Sammlung und Aufbewahrun…

Materials

Sterivex -GP 0.22 μm filter unit	Millipore	SVGP01050	Sampling
RNAlater Stabilization Solution	Ambion	AM7021	Sampling
Tris	Bio Basic	77-86-1 or TB0196-500G	Protein Extraction/ SDS PAGE gel
DTT	Sigma-Aldrich	D0632-1G	Protein Extraction
SDS	Bio Basic	15-21-3	Protein Extraction/ SDS PAGE gel
EDTA	Bio Basic	6381-92-6	Protein Extraction
Glycerol	Fisher Scientific	56-81-5	Protein Extraction
10K Amicon Filter	Millipore	UFC801024	Protein Extraction
Methanol	Sigma-Aldrich	179337-4L	Protein Precipitation
Acetone	Fisher Scientific	67-64-1	Protein Precipitation
MPC Protein Precipitation reagent	Epicenter	mmP03750	DNA Precipitation
2-Propanol	Fisher Scientific	67-63-0	DNA Precipitation
Qubit dsDNA BR Assay kit	Life Technologies	Q32850	DNA Quantification
Qubit Protein Assay kit	Life Technologies	Q33211	Protein Quantification
Sucrose	Bio Basic	57-50-1	SDS PAGE gel
TEMED	Bio Rad	161-0800	SDS PAGE gel
APS	Bio Rad	161-0700	SDS PAGE gel
30% Acrylamide	Bio Rad	161-0158	SDS PAGE gel
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060	SDS PAGE gel
Glycine	Bio Rad	161-0718	SDS PAGE gel
B-mercaptoethanol	Bio Basic	60-24-2	SDS PAGE gel
Laemmli Sample Buffer	Bio Rad	161-0737	SDS PAGE gel
Precision Plus Protein Kaleidoscope Ladder	Bio Rad	161-0375EDU	SDS PAGE gel
Acetonitrile	VWR	CABDH6044-4	In-gel Trypsin digest
NH4HCO3	Bio Basic	1066-33-7	In-gel Trypsin digest
DTT	Sigma-Aldrich	D0632-1G	In-gel Trypsin digest
Formic Acid	Sigma-Aldrich	F0507-500ML	In-gel Trypsin digest
HPLC grade H2O	Sigma-Aldrich	270733-4L	In-gel Trypsin digest
Iodoacetamide	Bio Basic	144-48-9	In-gel Trypsin digest
Trypsin	Promega	V5111	In-gel Trypsin digest
Protein LoBind Tube 1.5ml	Eppendorf	22431081	In-gel Trypsin digest
2mL ROBO vial 9mm	Candian Life Science	VT009/C395SB	In-gel Trypsin digest
PP BM insert, No spring	Candian Life Science	4025P-631	In-gel Trypsin digest