Un flusso di lavoro metaproteomica Aquatic microbica: dalle celle ai Trittico Peptidi per l'analisi basata su spettrometria di massa tandem

Summary

This protocol is for the extraction and concentration of protein and DNA from microbial biomass collected from seawater, followed by the generation of tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based proteomic analysis.

Abstract

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and metabolism. Although powerful, metagenomics alone can only elucidate functional potential. On the other hand, metaproteomics enables the description of the expressed in situ metabolism and function of a community. Here we describe a protocol for cell lysis, protein and DNA isolation, as well as peptide digestion and extraction from marine microbial cells collected on a cartridge filter unit (such as the Sterivex filter unit) and preserved in an RNA stabilization solution (like RNAlater). In mass spectrometry-based proteomics studies, the identification of peptides and proteins is performed by comparing peptide tandem mass spectra to a database of translated nucleotide sequences. Including the metagenome of a sample in the search database increases the number of peptides and proteins that can be identified from the mass spectra. Hence, in this protocol DNA is isolated from the same filter, which can be used subsequently for metagenomic analysis.

Introduction

I microrganismi sono onnipresenti e svolgono ruoli essenziali nel cicli biogeochimici della Terra ^1. Attualmente, ci sono numerosi approcci molecolari disponibili per caratterizzare la struttura comunità microbica e funzione. Più comune è l'analisi del gene 16S rRNA sequenze PCR-amplificato dal DNA ambientale ^2-4. Uno svantaggio di analisi del gene 16S rRNA è che fornisce solo informazioni sull'identità filogenetica e struttura della comunità, con poche informazioni sulla funzione metabolica. Al contrario, approcci come metagenomica, metatranscriptomics e metaproteomica forniscono informazioni sulla struttura delle comunità e il metabolismo. Metagenomica o l'analisi del contenuto gene di un assemblaggio di organismi, fornisce informazioni sulla struttura e potenzialità funzionali della comunità ^{5 – 8.} Anche se potente, questo potenziale funzionale potrebbe non corrispondere al metabolicaattività degli organismi. Genotipo di un organismo è rappresentata dai suoi geni, ognuno dei quali può essere trascritto RNA e in seguito tradotti alla proteina, causando un fenotipo. Così, per aiutare nella comprensione della attività funzionale microbica in un ambiente, l'analisi post-genomica deve essere eseguita ^9. Metatranscriptomics, o l'analisi dei trascritti di RNA è utile perché rivela quali geni sono trascritti in un determinato ambiente. Tuttavia, i livelli di mRNA non sempre corrispondono ai livelli di proteina corrispondente a causa di regolazione traduzionale, RNA emivita, e il fatto che più copie della proteina possono essere generati per ogni mRNA ^10.

Per questi motivi metaproteomica è ormai riconosciuta come un importante strumento per microbiologia ambientale. Metaproteomic comune analizza utilizzare un approccio di proteomica fucile da caccia dove la serie completa nei pressi di proteine ​​in un campione complesso sono purificati e analizzati allo stesso tempo, di solito attraverso itdigestione enzimatico in peptidi e analisi su uno spettrometro di massa. Spettrometria di massa tandem successivo (MS / MS) "peptide fingerprinting" è utilizzato per determinare la sequenza di peptidi e proteine ​​di origine potenziale da database di proteine ​​ricerca (per una rassegna vedi ^11). Lavoro proteomica ha fatto molta strada negli ultimi 25 anni grazie all'aumento di genomica disponibilità dei dati e l'aumento della sensibilità e la precisione di spettrometri di massa che consentano l'identificazione di proteine ​​ad alto rendimento e la quantificazione ^11,12. Poiché le proteine ​​sono il prodotto finale di espressione genica, i dati metaproteomic può aiutare a determinare quali organismi sono attivi in ​​un determinato ambiente e quali proteine ​​stanno esprimendo. Questo è vantaggioso quando si cerca di determinare come un particolare insieme di variabili ambientali influenzerà il fenotipo di un organismo o di una comunità. All'inizio, gli studi metaproteomic basate su MS MS / nell'oceano sono stati usati per identificare le proteine ​​specifiche in miratalignaggi microbici, con il primo studio incentrato sulla luce guidato protonica pompa proteorodopsina in SAR11 batteri marini ^13. Più di recente, le analisi comparative metaproteomic hanno chiarito pattern di espressione proteica differenziali tra le comunità complesse. Gli esempi includono l'identificazione di variazioni temporali nel metabolismo del litorale nord-occidentale dell'Oceano Atlantico ^{14 o} la Penisola Antartica ^5. Altri studi hanno descritto variazioni dei pattern di espressione proteica attraverso scale spaziali, ad esempio, lungo un transetto geografica da un oceano bassa nutrienti gyre ad un sistema upwelling costiero altamente produttivo ^15. Per ulteriori recensioni di metaproteomica si consiglia Schneider et al. (2010) ⁹ e Williams et al. (2014) ^16. Proteomica mirate sono stati anche impiegati negli ultimi anni per quantificare l'espressione di specifiche vie metaboliche nell'ambiente ^17,18.

There sono tre fasi principali nell'analisi metaproteomic. La prima fase è la preparazione del campione, che comprende la raccolta del campione, la lisi cellulare e la concentrazione di proteine. Raccolta dei campioni in microbiologia marina spesso comporta la filtrazione di acqua marina attraverso un pre-filtro per rimuovere le cellule eucariotiche grandi, particelle e batteri particelle-associata, seguita da filtrazione per la cattura di cellule microbiche vivere liberi, comunemente con l'uso di una cartuccia di 0,22 micron unità filtro ^19,20. Questi filtri sono incased in un cilindro di plastica e una lisi cellulare e protocollo di estrazione proteina che può essere effettuata all'interno del gruppo filtro sarebbe uno strumento prezioso. Una volta ottenuta la biomassa, le cellule devono essere lisate per consentire l'estrazione delle proteine. Diversi metodi possono essere impiegati, compresi guanidina-HCl ²¹ lisi e sodio dodecil solfato (SDS) metodi basati lisi. Anche se i detersivi come SDS sono molto efficienti a distruggere le membrane e solubilizzando molti tipi di proteine, Concentrations partire da 0,1% a valle può interferire con la digestione delle proteine ​​e MS analisi ^22. Di grande preoccupazione è gli effetti negativi della SDS su tripsina efficienza digestione, potere risolutivo della retromarcia cromatografia liquida fase e soppressione ionica o l'accumulo all'interno della sorgente di ioni ^23.

La seconda fase è frazionamento e analisi, in cui le proteine ​​vengono sottoposti a digestione enzimatica seguita da analisi LC MS / MS, conseguente am / z modello frammentazione che può essere utilizzata per determinare la sequenza amminoacidica primaria del peptide triptico iniziale. Vari metodi di digestione può essere eseguita a seconda delle tipologie di detergenti utilizzati, nonché il workflow spettrometria di massa a valle. Nel nostro protocollo, 1-D elettroforesi PAGE seguita dalla rimozione di SDS dal gel viene utilizzato per eliminare eventuali contaminazioni detergente. L'analisi delle proteine ​​che sono difficili da solubilizzare, come le proteine ​​di membrana, richiede l'uso di alta concenzioni di SDS o altri detergenti. Questo porta a problemi di compatibilità con elettroforesi SDS-gel. Se l'obiettivo di uno studio richiede la solubilizzazione di questi difficile da solubilizzare le proteine, il sistema tubo-gel può essere usato ^22,24. Il metodo del tubo-gel incorpora proteine ​​all'interno della matrice gel senza l'uso di elettroforesi. Successivamente detergenti utilizzati per la solubilizzazione vengono rimossi prima di digestione delle proteine.

La terza fase è l'analisi bioinformatica. In questa fase i dati peptidici MS / MS vengono ricercati con un database di sequenze nucleotidiche tradotti per determinare quali sono presenti nel campione peptidi e proteine. L'identificazione di peptidi dipende database viene ricercato contro. Dati metaproteomic marini sono comunemente cercati nei database costituiti da genomi di riferimento, dati metagenomiche come il set di dati Global Ocean Sampling ^25, così come cellulari amplificati genomi singoli da li incoltoneages ^26,27. L'identificazione delle proteine ​​può essere aumentato anche l'inclusione di sequenze metagenomiche dallo stesso campione come dati metaproteomic stato derivato ^5.

Qui forniamo un protocollo per la generazione di peptidi adatti per l'analisi MS MS / da biomassa microbica raccolti per filtrazione e memorizzati in una soluzione di stabilizzazione RNA. Il protocollo qui descritto permette di DNA e proteine ​​per essere isolati dallo stesso campione in modo che tutte le fasi che portano alla proteina e precipitazioni DNA sono identici. Dal punto di vista pratico, meno filtrazione è necessaria poiché solo filtro è necessario per proteine ​​e estrazione del DNA. Vorremmo anche riconoscere che questo protocollo è stato creato attraverso la combinazione, l'adattamento e la modifica di due protocolli precedentemente pubblicati. I passi lisi cellulare sono adattati da Saito et al. (2011) ^{28 e} la tripsina in-gel digerire componente è adattato da Shevchenko et al. (2007) ^29.

Protocol

1. Preparare Reagenti Preparare la soluzione SDS-estrazione: 0.1 M Tris-HCl pH 7,5, 5% glicerolo, EDTA 10 mM e 1% SDS. Filtro-sterilizzare utilizzando un filtro e conservare 0,22 micron a 4 ° C. Preparare i reagenti azionari necessari per il gel di poliacrilammide. Preparare 1.5 M Tris-HCl pH 8.8. Filtro-sterilizzare con un filtro di 0,22 micron e conservare a temperatura ambiente. 0.5 M Tris-HCl pH 6.8. Filtro-sterilizzare con un filtro di 0,22 micron e conservare a temperatura …

Representative Results

A dimostrazione, abbiamo eseguito il protocollo su due campioni di acqua di mare prelevati dalla superficie e la clorofilla massima del mare costiera nel nord del Canada. Mentre in mare, 6-7 L di acqua di mare è stato passato attraverso un 3 micron GF / D prefiltro, quindi le cellule microbiche sono state raccolte su un filtro di 0,22 micron unità cartuccia seguendo il protocollo di Walsh et al. 20. Le cellule sono state immediatamente memorizzati in una soluzione di stabilizzatore RNA fino al proc…

Discussion

Conservazione del campione è fondamentale per gli studi metaproteomic e lavoro precedente ha dimostrato che una soluzione di stabilizzazione RNA è un buffer di archiviazione utile per conservare le cellule prima dell'estrazione delle proteine ^​​28. Idealmente, i campioni dovrebbero essere conservati in situ di negare cambiamenti nell'espressione delle proteine ​​durante la movimentazione ^33,34. Infatti, in situ sono state sviluppate tecnologie di campionamento e …

Materials

Sterivex -GP 0.22 μm filter unit	Millipore	SVGP01050	Sampling
RNAlater Stabilization Solution	Ambion	AM7021	Sampling
Tris	Bio Basic	77-86-1 or TB0196-500G	Protein Extraction/ SDS PAGE gel
DTT	Sigma-Aldrich	D0632-1G	Protein Extraction
SDS	Bio Basic	15-21-3	Protein Extraction/ SDS PAGE gel
EDTA	Bio Basic	6381-92-6	Protein Extraction
Glycerol	Fisher Scientific	56-81-5	Protein Extraction
10K Amicon Filter	Millipore	UFC801024	Protein Extraction
Methanol	Sigma-Aldrich	179337-4L	Protein Precipitation
Acetone	Fisher Scientific	67-64-1	Protein Precipitation
MPC Protein Precipitation reagent	Epicenter	mmP03750	DNA Precipitation
2-Propanol	Fisher Scientific	67-63-0	DNA Precipitation
Qubit dsDNA BR Assay kit	Life Technologies	Q32850	DNA Quantification
Qubit Protein Assay kit	Life Technologies	Q33211	Protein Quantification
Sucrose	Bio Basic	57-50-1	SDS PAGE gel
TEMED	Bio Rad	161-0800	SDS PAGE gel
APS	Bio Rad	161-0700	SDS PAGE gel
30% Acrylamide	Bio Rad	161-0158	SDS PAGE gel
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060	SDS PAGE gel
Glycine	Bio Rad	161-0718	SDS PAGE gel
B-mercaptoethanol	Bio Basic	60-24-2	SDS PAGE gel
Laemmli Sample Buffer	Bio Rad	161-0737	SDS PAGE gel
Precision Plus Protein Kaleidoscope Ladder	Bio Rad	161-0375EDU	SDS PAGE gel
Acetonitrile	VWR	CABDH6044-4	In-gel Trypsin digest
NH4HCO3	Bio Basic	1066-33-7	In-gel Trypsin digest
DTT	Sigma-Aldrich	D0632-1G	In-gel Trypsin digest
Formic Acid	Sigma-Aldrich	F0507-500ML	In-gel Trypsin digest
HPLC grade H2O	Sigma-Aldrich	270733-4L	In-gel Trypsin digest
Iodoacetamide	Bio Basic	144-48-9	In-gel Trypsin digest
Trypsin	Promega	V5111	In-gel Trypsin digest
Protein LoBind Tube 1.5ml	Eppendorf	22431081	In-gel Trypsin digest
2mL ROBO vial 9mm	Candian Life Science	VT009/C395SB	In-gel Trypsin digest
PP BM insert, No spring	Candian Life Science	4025P-631	In-gel Trypsin digest