بديل بسيط لحقن المجسم لالدماغ ضربة قاضية محددة من ميرنا
Summary
MicroRNAs play crucial roles in the brain and are potential targets for modeling neuro-degeneration. However, perturbing miRNA levels is challenging due to the short length of miRNA and inaccessibility of the brain tissue. This video presents a method for antagomir design and brain specific delivery using a neuropeptide in mice.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression. In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the correct expression of microRNAs. Perturbation of microRNAs in the brain can be used to model neurodegenerative diseases by modulating neuronal cell death. Currently, stereotactic injection is used to deliver miRNA knockdown agents to specific location in the brain. Here, we discuss strategies to design antagomirs against miRNA with locked nucleotide modifications (LNA). Subsequently describe a method for brain specific delivery of antagomirs, uniformly across different regions of the brain. This method is simple and widely applicable since it overcomes the surgery, associated injury and limitation of local delivery in stereotactic injections. We prepared a complex of neurotropic, cell-penetrating peptide Rabies Virus Glycoprotein (RVG) with antagomir against miRNA-29 and injected through tail vein, to specifically deliver in the brain. The antagomir design incorporated features that allow specific targeting of the miRNA and formation of non-covalent complexes with the peptide. The knock-down of the miRNA in neuronal cells, resulted in apoptotic cell death and associated behavioural defects. Thus, the method can be used for acute models of neuro-degeneration through the perturbation of miRNAs.
Introduction
ظهرت MicroRNAs كأهداف علاجية جديدة بسبب الدور العالمي في تنظيم التعبير الجيني وأدلة مباشرة للمشاركة في المرض. ويجري بحث MiRNAs بنشاط لإمكاناتهم كأهداف المخدرات 1،2. وعلاوة على ذلك، ترتبط التعديلات في التعبير ميرنا مع العديد من الأمراض 3 والمحاكاة من هذه التغييرات اضطراب الاصطناعي من ميرنا التعبير يمكن استخدامها لدراسة مسارات الخلوية المشاركة في مظاهر المرض. الأنسجة تسليم محددة من ميرنا المخدرات تستهدف حاليا تحديا كبيرا لتطوير الأدوية ميرنا القائمة. Antagomirs ويحاكي ميرنا وكلاء واعدة لاحداث بلبلة مستويات ميرنا 4-6. ومع ذلك، السمات الخاصة التي تعزز خصوصيتها والفعالية يجب أن تكون دمجها في تصميم antagomirs قبل أنها يمكن أن تستخدم في الجسم الحي اضطراب ميرنا التعبير.
MicroRNAs هي ذات الصلة خاصة كأهداف في الاعصاب غير قابل للشفاء حاليا والأمراض العصبية التطورية. حاجز الدم في الدماغ يشكل قيدا لتسليم antagomirs في الدماغ. يتم استخدام الحقن المجسم على نطاق واسع في نماذج القوارض لتسليم الجزيئات في مواقع محددة في الدماغ 7. فهو يتطلب مهارة والاستثمار المكثف في الأجهزة والوقت. حقن المجسم هي الغازية، تنطوي عملية جراحية، تسبب ما لا يقل عن قاصر الإصابة وتقتصر على التسليم المحلي. استخدام الخلايا اختراق الببتيدات مع تفضيل الخلايا العصبية التي تستهدف يمكن مواجهة هذه القيود لأنها يمكن أن يتم تسليمها عبر الطريق عبر الأوعية الدموية ولكن اختراق حاجز الدم في الدماغ. هذا الببتيد المستمدة من فيروس داء الكلب البروتين السكري (RVG)، وكان يستخدم في السابق لتسليم سيرنا ضد فيروس التهاب الدماغ الياباني في الفئران 8. لقد وجدنا أن استخدام الببتيد لantagomir التسليم، miRNAs يمكن أن تكون فعالة ترسيتها في مخ الفأر 9.
ontent "> إن التحدي الرئيسي الثاني للميرنا تدق إلى أسفل ينشأ من صغر حجم miRNAs وجود إيسفورمس تسلسل ارتباطا وثيقا. نحن نأخذ مثال MMU-مير 29 عائلة التي تتكون من ثلاثة إيسفورمس ترتبط ارتباطا وثيقا، مير-29A و b و c. كما المعدلة Antagomirs عموما على طول العمود الفقري لزيادة استقرارها وجعلها مقاومة للهجوم من قبل nucleases. مغلق الأحماض النووية (LNAs) توفر ميزة أخرى أنها تعزز الاستقرار الحراري وتؤدي إلى استهداف تدهور أكثر وخارجها عائق الفراغية 10. تقديم تعديلات على طول العمود الفقري يمكن أن تكون فعالة ولكنها مكلفة. لقد رأينا في وقت سابق أن التعديلات يتجاوز العدد الأمثل قد لا تزيد من تعزيز فعالية. وبالتالي، فإن تصميم antagomir ينطوي على تعديل الأمثل للantagomir.لمجمع antagomir غير تساهمي مع الببتيد موجه للعصب، واتهم سباعي لتمديد NONA أرجينين يستخدم. D-ارجينينوتستخدم المخلفات لأنها تمنح أعلى الاستقرار لأنها ليست عرضة للانشقاق من قبل البروتياز. سباعي إلى NONA أرجينين مساحات العمل خلية اختراق كلاء فعالة قدر، على الرغم من أنها لا تضفي نوع من الخلايا خصوصية. من خلال ربط تساهمي الببتيد RVG إلى رابط NONA أرجينين، وهو موجه للعصب، تم إنشاء خلية اختراق الببتيد. بقايا موجبة الشحنة من الببتيد تتفاعل مع الشحنة السالبة العمود الفقري الحمض النووي، لتشكيل المجمعات. هذه المجمعات يمكن استخدامها ل transfect فعال DNA أو RNA في الخلايا المستزرعة والحية في الأنسجة.
Protocol
Representative Results
Discussion
Here we demonstrate a widely accessible methodology to study the effects of miRNA modulation. Currently, most attempts at in vivo characterization of miRNA functions involve the creation of knockout mice or a transgenic that expresses a miRNA sponge. Most miRNAs, even the cell type specific ones are expressed in more than one organ. For instance, miRNAs initially thought to be specific to the hematopoietic system are also expressed in the brain, due to the presence of microglia. Thus even a cell type specifi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Souvik Maiti for help in designing the antagomirs. We also acknowledge Rangeetha J. Naik, Rakesh Dey, and Bijay Pattnaik for their help with experimental methods. This work was funded by the Council of Scientific and Industrial Research (BSC0123). HS, MV and RR acknowledge fellowship from the Council of Scientific and Industrial Research, India. MAS acknowledge fellowship from the University Grants Commission, India.
Materials
| Vortex | |||
| Restrainer or Decapicone | |||
| Narrow runway | ~70-cm-long, ~5-cm-wide with ~5-cm-high walls. | ||
| Reagents | |||
| Fluorescently labelled oligonucleotides (siGLO) | GE Healthcare Dharmacon INC | D0016300120 | |
| 10% sterile D-glucose | |||
| Antagomir-29 | Exiqon | custom synthesis | |
| Antagomir-control | Exiqon | custom synthesis | |
| Neuropeptide RVG | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Neuropeptide RVM | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| 其他 | |||
| Cotton | |||
| Warm water | |||
| Insulin syringes | |||
| Absorbent sheets | |||
| Ink | |||
| Brush | |||
| Antiseptic |
References
- Roshan, R., Ghosh, T., Scaria, V., Pillai, B. MicroRNAs: novel therapeutic targets in neurodegenerative diseases. Drug discovery today. 14, 1123-1129 (2009).
- Maes, O. C., Chertkow, H. M., Wang, E., Schipper, H. M. MicroRNA: Implications for Alzheimer Disease and other Human CNS Disorders. Current Genomics. 10, 154-168 (2009).
- Soifer, H. S., Rossi, J. J., Saetrom, P. MicroRNAs in Disease and Potential Therapeutic Applications. Mol Ther. 15, 2070-2079 (2007).
- Bader, A. G., Brown, D., Winkler, M. The Promise of MicroRNA Replacement Therapy. Cancer research. 70, 7027-7030 (2010).
- Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3, 1-17 (2012).
- Trang, P., et al. Systemic Delivery of Tumor Suppressor microRNA Mimics Using a Neutral Lipid Emulsion Inhibits Lung Tumors in Mice. Molecular Therapy. 19, 1116-1122 (2011).
- Barbash, S., Hanin, G., Soreq, H. Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome. J Vis Exp. (76), e50170 (2013).
- Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448, 39-43 (2007).
- Roshan, R., et al. Brain-specific knockdown of miR-29 results in neuronal cell death and ataxia in mice. RNA. 20, 1287-1297 (2014).
- Kaur, H., Wengel, J., Maiti, S. Thermodynamics of DNA−RNA Heteroduplex Formation: Effects of Locked Nucleic Acid Nucleotides Incorporated into the DNA Strand. 生物化学. 47, 1218-1227 (2008).
- Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., Van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34, D140-D144 (2006).
- Kaur, H., Babu, B. R., Maiti, S. Perspectives on Chemistry and Therapeutic Applications of Locked Nucleic Acid (LNA). Chemical Reviews. 107, 4672-4697 (2007).
- Guyenet, S. J., et al. A Simple Composite Phenotype Scoring System for Evaluating Mouse Models of Cerebellar Ataxia. J. Vis. Exp. (39), (2010).
- Bergen, J. M., Park, I. -. K., Horner, P. J., Pun, S. H. Nonviral Approaches for Neuronal Delivery of Nucleic Acids. Pharmaceutical Research. 25, 983-998 (2008).
- Zou, L. -. L., Ma, J. -. L., Wang, T., Yang, T. -. B., Liu, C. -. B. Cell-Penetrating Peptide-Mediated Therapeutic Molecule Delivery into the Central Nervous System. Current Neuropharmacology. 11, 197-208 (2013).
- Hwang, D. W., et al. A brain-targeted rabies virus glycoprotein-disulfide linked PEI nanocarrier for delivery of neurogenic microRNA. Biomaterials. 32, 4968-4975 (2011).
