Een eenvoudig alternatief voor stereotactische Injectie voor Brain Specifieke Knockdown van miRNA
Summary
MicroRNAs play crucial roles in the brain and are potential targets for modeling neuro-degeneration. However, perturbing miRNA levels is challenging due to the short length of miRNA and inaccessibility of the brain tissue. This video presents a method for antagomir design and brain specific delivery using a neuropeptide in mice.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression. In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the correct expression of microRNAs. Perturbation of microRNAs in the brain can be used to model neurodegenerative diseases by modulating neuronal cell death. Currently, stereotactic injection is used to deliver miRNA knockdown agents to specific location in the brain. Here, we discuss strategies to design antagomirs against miRNA with locked nucleotide modifications (LNA). Subsequently describe a method for brain specific delivery of antagomirs, uniformly across different regions of the brain. This method is simple and widely applicable since it overcomes the surgery, associated injury and limitation of local delivery in stereotactic injections. We prepared a complex of neurotropic, cell-penetrating peptide Rabies Virus Glycoprotein (RVG) with antagomir against miRNA-29 and injected through tail vein, to specifically deliver in the brain. The antagomir design incorporated features that allow specific targeting of the miRNA and formation of non-covalent complexes with the peptide. The knock-down of the miRNA in neuronal cells, resulted in apoptotic cell death and associated behavioural defects. Thus, the method can be used for acute models of neuro-degeneration through the perturbation of miRNAs.
Introduction
MicroRNAs zijn ontstaan als nieuwe therapeutische targets te wijten aan hun universele rol in de regulering van genexpressie en direct bewijs voor de betrokkenheid bij de ziekte. MiRNAs worden actief onderzocht voor hun potentieel als drug targets 1,2. Verder, veranderingen in miRNA expressie zijn geassocieerd met verschillende aandoeningen 3 en simulatie van deze veranderingen door kunstmatige verstoring van miRNA expressie kan worden gebruikt om de cellulaire routes betrokken bij de ziekte manifestatie bestuderen. Weefsel specifieke aflevering van miRNA targeting drugs is momenteel een grote uitdaging voor miRNA gebaseerde ontwikkeling van geneesmiddelen. Antagomirs en miRNA bootst zijn veelbelovend agenten voor verstoren miRNA niveaus 4-6. Echter, speciale functies die hun specificiteit en doeltreffendheid te verbeteren hebben in het ontwerp van antagomirs op te nemen voordat ze kunnen worden toegepast voor in vivo verstoring van miRNA expressie.
MicroRNAs zijn vooral relevant als doelen in momenteel ongeneeslijke neurodegeneratieve en neuro-ontwikkelingsstoornissen ziekten. De bloed-hersenbarrière vormt een beperking voor de levering van antagomirs de hersenen. Stereotactische injecties worden veel gebruikt in diermodellen om moleculen op specifieke locaties te leveren in de hersenen 7. Het vereist vaardigheid, omvangrijke investeringen in instrumentatie en tijd. Stereotactische injecties zijn invasief, betrekken chirurgie, veroorzaken ten minste lichte verwondingen en zijn beperkt tot lokale levering. Het gebruik van mobiele penetrerende peptiden met een voorkeur voor het richten neuronen kunnen deze beperkingen tegengaan aangezien zij door de trans-vasculaire route kan worden geleverd, maar schenden de bloed-hersenbarrière. Een dergelijk peptide afgeleid van het rabiësvirus glycoproteïne (RVG), is eerder gebruikt om siRNA leveren tegen Japanse encefalitis virus bij muizen 8. We vonden dat het gebruik van het peptide voor antagomir levering, miRNAs effectief kan worden neergehaald in muizenhersenen 9.
NHOUD "> De tweede grote uitdaging van miRNA neerhalen komt voort uit de geringe omvang van miRNAs en de aanwezigheid van nauw verwante sequentie isovormen. We nemen het voorbeeld van de MMU-miR-29 familie die bestaat uit drie nauw verwante isovormen, miR-29a , b en c. antagomirs zijn meestal ook gewijzigd langs de ruggengraat om hun stabiliteit te verhogen en ze bestand zijn tegen aantasting door nucleasen render. Locked Nucleic Acids (LNA) bieden een verder voordeel dat de thermische stabiliteit en zelfs leiden tot afbraak over en voorbij richten sterische hindering 10. Invoering wijzigingen langs de hoofdketen effectief maar duur kunnen zijn. Wij hebben eerder gezien dat modificaties voorbij een optimaal aantal niet verder verbeteren van de werkzaamheid. Het ontwerp van de antagomir gaat dus om optimale aanpassing van de antagomir.Om de complexe antagomir niet-covalente wijze met de neurotrope peptide, een geladen hepta- tot nona-arginine extensie wordt gebruikt. D-Arginineresiduen worden gebruikt omdat daarmee een hogere stabiliteit zij niet gevoelig zijn voor splitsing door proteasen. Hepta- tot nona-arginine trajecten dienen als efficiënte cel penetrerende middelen, hoewel ze verleent celtype specificiteit. Door covalente koppeling van het peptide aan het RVG nona-arginine linker, een neurotrope celpenetrerende peptide werd gegenereerd. De positief geladen resten van het peptide interactie met de negatief geladen nucleïnezuur backbone, tot complexen. Deze complexen kunnen worden gebruikt om effectief te transfecteren DNA of RNA in gekweekte cellen en in vivo in weefsels.
Protocol
Representative Results
Discussion
Here we demonstrate a widely accessible methodology to study the effects of miRNA modulation. Currently, most attempts at in vivo characterization of miRNA functions involve the creation of knockout mice or a transgenic that expresses a miRNA sponge. Most miRNAs, even the cell type specific ones are expressed in more than one organ. For instance, miRNAs initially thought to be specific to the hematopoietic system are also expressed in the brain, due to the presence of microglia. Thus even a cell type specifi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Souvik Maiti for help in designing the antagomirs. We also acknowledge Rangeetha J. Naik, Rakesh Dey, and Bijay Pattnaik for their help with experimental methods. This work was funded by the Council of Scientific and Industrial Research (BSC0123). HS, MV and RR acknowledge fellowship from the Council of Scientific and Industrial Research, India. MAS acknowledge fellowship from the University Grants Commission, India.
Materials
| Vortex | |||
| Restrainer or Decapicone | |||
| Narrow runway | ~70-cm-long, ~5-cm-wide with ~5-cm-high walls. | ||
| Reagents | |||
| Fluorescently labelled oligonucleotides (siGLO) | GE Healthcare Dharmacon INC | D0016300120 | |
| 10% sterile D-glucose | |||
| Antagomir-29 | Exiqon | custom synthesis | |
| Antagomir-control | Exiqon | custom synthesis | |
| Neuropeptide RVG | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Neuropeptide RVM | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| 其他 | |||
| Cotton | |||
| Warm water | |||
| Insulin syringes | |||
| Absorbent sheets | |||
| Ink | |||
| Brush | |||
| Antiseptic |
References
- Roshan, R., Ghosh, T., Scaria, V., Pillai, B. MicroRNAs: novel therapeutic targets in neurodegenerative diseases. Drug discovery today. 14, 1123-1129 (2009).
- Maes, O. C., Chertkow, H. M., Wang, E., Schipper, H. M. MicroRNA: Implications for Alzheimer Disease and other Human CNS Disorders. Current Genomics. 10, 154-168 (2009).
- Soifer, H. S., Rossi, J. J., Saetrom, P. MicroRNAs in Disease and Potential Therapeutic Applications. Mol Ther. 15, 2070-2079 (2007).
- Bader, A. G., Brown, D., Winkler, M. The Promise of MicroRNA Replacement Therapy. Cancer research. 70, 7027-7030 (2010).
- Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3, 1-17 (2012).
- Trang, P., et al. Systemic Delivery of Tumor Suppressor microRNA Mimics Using a Neutral Lipid Emulsion Inhibits Lung Tumors in Mice. Molecular Therapy. 19, 1116-1122 (2011).
- Barbash, S., Hanin, G., Soreq, H. Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome. J Vis Exp. (76), e50170 (2013).
- Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448, 39-43 (2007).
- Roshan, R., et al. Brain-specific knockdown of miR-29 results in neuronal cell death and ataxia in mice. RNA. 20, 1287-1297 (2014).
- Kaur, H., Wengel, J., Maiti, S. Thermodynamics of DNA−RNA Heteroduplex Formation: Effects of Locked Nucleic Acid Nucleotides Incorporated into the DNA Strand. 生物化学. 47, 1218-1227 (2008).
- Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., Van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34, D140-D144 (2006).
- Kaur, H., Babu, B. R., Maiti, S. Perspectives on Chemistry and Therapeutic Applications of Locked Nucleic Acid (LNA). Chemical Reviews. 107, 4672-4697 (2007).
- Guyenet, S. J., et al. A Simple Composite Phenotype Scoring System for Evaluating Mouse Models of Cerebellar Ataxia. J. Vis. Exp. (39), (2010).
- Bergen, J. M., Park, I. -. K., Horner, P. J., Pun, S. H. Nonviral Approaches for Neuronal Delivery of Nucleic Acids. Pharmaceutical Research. 25, 983-998 (2008).
- Zou, L. -. L., Ma, J. -. L., Wang, T., Yang, T. -. B., Liu, C. -. B. Cell-Penetrating Peptide-Mediated Therapeutic Molecule Delivery into the Central Nervous System. Current Neuropharmacology. 11, 197-208 (2013).
- Hwang, D. W., et al. A brain-targeted rabies virus glycoprotein-disulfide linked PEI nanocarrier for delivery of neurogenic microRNA. Biomaterials. 32, 4968-4975 (2011).
