microRNA 在大脑中发挥着关键作用，并且是神经退行性疾病建模的潜在靶点。然而，由于 microRNA 序列较短且脑组织难以接近，调控其表达水平具有较大挑战性。本视频介绍了一种在小鼠中利用神经肽设计拮抗寡核苷酸（antagomir）并实现脑部特异性递送的方法。
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方法文章
一种用于脑部特异性敲低miRNA的简单替代性立体定位注射方法
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
microRNA（miRNA）是基因表达的关键调控因子。在大脑中，神经发育和神经元功能等重要过程依赖于microRNA的正确表达。通过调控神经元细胞死亡，干扰大脑中的microRNA可用于建立神经退行性疾病的模型。目前，通常采用立体定位注射将miRNA敲低试剂递送至大脑的特定部位。本文讨论了设计针对具有锁核酸修饰（LNA）的miRNA的antagomir的策略，并随后描述了一种可在大脑不同区域实现antagomir均匀递送的脑部特异性递送方法。该方法简便且具有广泛适用性，因为它克服了立体定位注射所需的手术操作、相关组织损伤以及局部递送的局限性。我们制备了神经嗜性细胞穿透肽——狂犬病病毒糖蛋白（Rabies Virus Glycoprotein, RVG）与靶向miRNA-29的antagomir的复合物，并通过尾静脉注射实现脑部特异性递送。该antagomir的设计包含了可特异性靶向miRNA以及与肽段形成非共价复合物的功能元件。在神经元细胞中miRNA的敲低导致了凋亡性细胞死亡及相关行为缺陷。因此，该方法可通过干扰miRNA构建神经退行性疾病的急性模型。
引言
微小RNA（microRNAs）因其在基因表达调控中的普遍作用以及参与疾病的直接证据，已成为新兴的治疗靶点。目前，微小RNA正被积极研究作为药物靶点的潜力。1,2此外，miRNA 表达的改变与多种疾病相关3 通过人工干扰miRNA表达来模拟这些变化，可用于研究疾病表型相关的细胞通路。组织特异性递送靶向miRNA的药物目前是基于miRNA的药物开发面临的主要挑战。Antagomirs和miRNA模拟物是在调控miRNA水平方面具有前景的干预手段4–6然而，在将antagomirs用于实际应用之前，必须在其设计中引入能够增强其特异性和功效的特殊结构特征。 体内 miRNA 表达的扰动
microRNA 作为目前无法治愈的神经退行性疾病和神经发育性疾病的治疗靶点具有重要意义。血脑屏障限制了抗微小RNA（antagomir）在脑内的递送。立体定位注射在啮齿类动物模型中被广泛用于将分子递送至脑内特定区域7。该方法需要熟练的技术，且在仪器设备和时间上投入较大。立体定位注射具有侵入性，需进行手术操作，至少会造成轻微组织损伤，并且仅限于局部递送。使用具有神经元靶向倾向的细胞穿透肽可克服上述局限，因为这类肽可通过血管途径递送并穿透血脑屏障。一种源自狂犬病毒糖蛋白（Rabies Virus Glycoprotein, RVG）的肽此前已被用于在小鼠中递送针对日本脑炎病毒的siRNA....
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方案
注意：所有涉及动物实验的操作均已获得新德里基因组学与综合生物学研究所机构动物伦理委员会（IAEC）的批准（批准编号：IGIB/AEC/10/2013）。本实验方案专门优化用于将Antagomir-29靶向递送至脑组织，以实现miR-29的敲低。
1. 抑制性寡核苷酸设计策略
- 从 miRBase11（http://www.mirbase.org/）获取成熟 miRNA 序列。
- 利用 miRBase 记录中的“基因家族”链接获取相关 miRNA 家族成员的序列
（http://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_summary.pl?fam=MIPF0000009）。 - 对序列进行反向互补：可通过 http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html 提供的工具便捷地完成序列反向互补操作。
- 根据以下原则标记使用 LNA 进行修饰的位置：
-
....
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结果
根据本文所述方法，制备了50微克荧光标记寡核苷酸（FLO）与约850微克RVG肽以1:15摩尔电荷比（FLO : 肽）形成的复合物，并通过尾静脉单次注射。以非嗜神经性狂犬病病毒基质（RVM）肽与FLO的复合物作为递送对照。次日，分离小鼠脑组织和肝脏，制备单细胞悬液。在显微镜下观察细胞的绿色荧光。FLO-RVG复合物成功递送至脑细胞，在注射后最短一天内即可检测到绿色荧光，而在肝脏中未见荧光信号（图2B,2D）；而RVM肽介导的FLO则仅递送至肝脏，在脑细胞中未检测到荧光（图2A,2C）。
为了在小鼠脑内敲低 miR-29，设计了针对 miR-29 的反义寡核苷酸（antagomir），其中包含五个锁核酸（LNA）修饰。使用一种随机排列、不靶向任何 miRNA 的序列作为反义寡核苷酸对照（Antagomir-control）。将 50 微克 Antagomir-control 或 Antagomir-29 与约 850 微克 RVG 肽形成复合物，在连续 3 天内通过尾静脉注射给药，随后按图 1 所示进行每日行为学检测.......
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讨论
本文展示了一种广泛适用的方法，用于研究miRNA调控的影响。目前，大多数针对miRNA功能的体内研究通常依赖于构建基因敲除小鼠或表达miRNA海绵的转基因模型。大多数miRNA，即使是细胞类型特异性的miRNA，也在多个器官中表达。例如，最初被认为仅在造血系统中特异性表达的miRNA，由于小胶质细胞的存在，也在脑组织中表达。因此，即使采用细胞类型特异性的敲低策略——即在细胞类型特异性启动子控制下表达针对miRNA的反义分子——仍可能产生多效性效应。以miR-29家族miRNA为例，它们在脑、血细胞以及体内多个其他部位均有表达。因此，用于miRNA调控的遗传学工具适用范围有限，也不适用于药物开发或潜在治疗策略的测试。
通过简单的尾静脉注射即可递送 cargo，这使得该技术具有广泛的可及性。该方法还避免了使用慢病毒进行嗜神经递送。这一方法最初是为敲低嗜神经病毒而开发的，其三个功能域可进行模块化改造，从而实现细胞类型特异性的 miRNA 敲低，这三个功能域分别为细胞穿透肽、嗜神经肽和反义分子。例如，我们发现使用另一种特异性靶向 miR-29 的 antagomir 虽可.......
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披露
作者无任何利益冲突披露。
致谢
感谢Souvik Maiti在设计antagomir方面的帮助。我们还感谢Rangeetha J. Naik、Rakesh Dey和Bijay Pattnaik在实验方法上的协助。本工作由印度科学与工业研究委员会（BSC0123）资助。HS、MV和RR感谢印度科学与工业研究委员会提供的博士后奖学金。MAS感谢印度大学拨款委员会提供的博士后奖学金。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 涡旋振荡器 | |||
| 动物固定器或去角锥形管 | |||
| 狭窄跑道 | 长约70 cm，宽约5 cm，侧壁高约5 cm。 | ||
| 试剂 | |||
| 荧光标记寡核苷酸（siGLO） | GE Healthcare Dharmacon INC | D0016300120 | |
| 10% 无菌D-葡萄糖 | |||
| Antagomir-29 | Exiqon | 定制合成 | |
| Antagomir-对照 | Exiqon | 定制合成 | |
| 神经肽RVG | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | 定制合成 | >98% 纯度 |
| 神经肽RVM | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | 定制合成 | >98% 纯度 |
| 其他 | |||
| 棉球 | |||
| 温水 | |||
| 胰岛素注射器 | |||
| 吸水纸巾 | |||
| 墨水 | |||
| 刷子 | |||
| 消毒剂 |
参考文献
- Roshan, R., Ghosh, T., Scaria, V., Pillai, B. MicroRNAs: novel therapeutic targets in neurodegenerative diseases. Drug discovery today. 14, 1123-1129 (2009).
- Maes, O. C., Chertkow, H. M., Wang, E., Schipper, H. M. MicroRNA: Implications for Alzheimer Disease an....
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重印与许可
