Простой Альтернатива стереотаксической инъекции для мозга Удельный нокдаун микроРНК
Summary
MicroRNAs play crucial roles in the brain and are potential targets for modeling neuro-degeneration. However, perturbing miRNA levels is challenging due to the short length of miRNA and inaccessibility of the brain tissue. This video presents a method for antagomir design and brain specific delivery using a neuropeptide in mice.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression. In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the correct expression of microRNAs. Perturbation of microRNAs in the brain can be used to model neurodegenerative diseases by modulating neuronal cell death. Currently, stereotactic injection is used to deliver miRNA knockdown agents to specific location in the brain. Here, we discuss strategies to design antagomirs against miRNA with locked nucleotide modifications (LNA). Subsequently describe a method for brain specific delivery of antagomirs, uniformly across different regions of the brain. This method is simple and widely applicable since it overcomes the surgery, associated injury and limitation of local delivery in stereotactic injections. We prepared a complex of neurotropic, cell-penetrating peptide Rabies Virus Glycoprotein (RVG) with antagomir against miRNA-29 and injected through tail vein, to specifically deliver in the brain. The antagomir design incorporated features that allow specific targeting of the miRNA and formation of non-covalent complexes with the peptide. The knock-down of the miRNA in neuronal cells, resulted in apoptotic cell death and associated behavioural defects. Thus, the method can be used for acute models of neuro-degeneration through the perturbation of miRNAs.
Introduction
Микро возникли как новые терапевтические мишени из-за их универсальной роли в регуляции экспрессии генов и прямое доказательство причастности болезни. МикроРНК активно исследовал их потенциал в качестве лекарственного средства цели 1,2. Кроме того, изменения в экспрессии микроРНК связаны с несколькими заболеваниями 3 и моделирования этих изменений искусственным возмущением выражения микроРНК может быть использован для изучения клеточных путей, вовлеченных в проявлении заболевания. Тканеспецифическую доставка микроРНК, направленных наркотиков в настоящее время является серьезной проблемой для развития, основанного микроРНК наркотиков. Antagomirs и микроРНК имитирует перспективные средства для возмущающих уровней микроРНК 4-6. Тем не менее, особенности, которые повышают свою специфику и эффективность должны быть включены в дизайн antagomirs, прежде чем они могут быть использованы для возмущения в естественных условиях выражения микроРНК.
Микро особенно актуальны в качестве мишеней в настоящее время неизлечимой нейродегенеративных и нервно-развития заболеваний. Барьер гематоэнцефалический представляет ограничение на поставку antagomirs в головном мозге. Стереотаксические инъекции широко используются в моделях грызунов, чтобы доставить молекулы в определенные места в мозге 7. Это требует умения, значительные инвестиции в приборы и времени. Стереотаксические инъекции являются инвазивными, включать операции, вызывает, по меньшей мере незначительные травмы и ограничены локальной доставки. Использование клеточных пептидов проникать с предпочтением, направленных нейронов может противостоять эти ограничения, так как они могут быть доставлены через транс-сосудистой маршруту, но нарушают гематоэнцефалический барьер. Такой пептид, полученный из вируса бешенства гликопротеина (РВГ), ранее был использован, чтобы доставить миРНК против японского энцефалита Вирус у мышей 8. Мы обнаружили, что с помощью пептида по antagomir доставки, микроРНК может быть эффективно в нокдауне в мозге мыши 9.
ontent "> Второй важной задачей из микроРНК нокдаун возникает из-за небольшого размера микроРНК и наличие близкородственных изоформ последовательности. Возьмем пример MMU-Мир-29 семья, которая состоит из трех тесно связанных изоформ, микроРНК-29а , В и С. Antagomirs также обычно модифицируют по магистрали, чтобы увеличить их стабильность и делает их устойчивыми к воздействию нуклеаз. Закрытые нуклеиновых кислот (МШУ) предлагают дополнительное преимущество, что они увеличивают термическую стабильность и даже привести к целевой деградации над и за пространственное затруднение 10. внесения изменений вдоль всего позвоночника может быть эффективным, но дорогим. Ранее мы обнаружили, что модификации вне оптимального числа не может еще больше увеличить эффективность. Конструкция antagomir поэтому предполагает оптимальную модификацию antagomir.Для сложнее antagomir нековалентно с нейротропной пептида, заряженный гептабромированных к Нона-аргинин расширения используется. D-аргининостатки используются, так как они придают высокую стабильность, поскольку они не являются чувствительными к расщеплению протеазами. Гепта- на Нона-аргинин участках действуют как эффективные агенты клеток проникать, хотя они не предоставляют типа клеток специфику. По ковалентного связывания пептида RVG к нона-аргинина линкера, в нейротропных, мобильный проникая пептид был сгенерирован. Положительно заряженные остатки пептида взаимодействовать с отрицательно заряженной основной цепи нуклеиновой кислоты, с образованием комплексов. Эти комплексы могут быть использованы для эффективного трансфекции ДНК или РНК в культивируемые клетки и в естественных условиях в ткани.
Protocol
Representative Results
Discussion
Here we demonstrate a widely accessible methodology to study the effects of miRNA modulation. Currently, most attempts at in vivo characterization of miRNA functions involve the creation of knockout mice or a transgenic that expresses a miRNA sponge. Most miRNAs, even the cell type specific ones are expressed in more than one organ. For instance, miRNAs initially thought to be specific to the hematopoietic system are also expressed in the brain, due to the presence of microglia. Thus even a cell type specifi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Souvik Maiti for help in designing the antagomirs. We also acknowledge Rangeetha J. Naik, Rakesh Dey, and Bijay Pattnaik for their help with experimental methods. This work was funded by the Council of Scientific and Industrial Research (BSC0123). HS, MV and RR acknowledge fellowship from the Council of Scientific and Industrial Research, India. MAS acknowledge fellowship from the University Grants Commission, India.
Materials
| Vortex | |||
| Restrainer or Decapicone | |||
| Narrow runway | ~70-cm-long, ~5-cm-wide with ~5-cm-high walls. | ||
| Reagents | |||
| Fluorescently labelled oligonucleotides (siGLO) | GE Healthcare Dharmacon INC | D0016300120 | |
| 10% sterile D-glucose | |||
| Antagomir-29 | Exiqon | custom synthesis | |
| Antagomir-control | Exiqon | custom synthesis | |
| Neuropeptide RVG | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Neuropeptide RVM | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| 其他 | |||
| Cotton | |||
| Warm water | |||
| Insulin syringes | |||
| Absorbent sheets | |||
| Ink | |||
| Brush | |||
| Antiseptic |
References
- Roshan, R., Ghosh, T., Scaria, V., Pillai, B. MicroRNAs: novel therapeutic targets in neurodegenerative diseases. Drug discovery today. 14, 1123-1129 (2009).
- Maes, O. C., Chertkow, H. M., Wang, E., Schipper, H. M. MicroRNA: Implications for Alzheimer Disease and other Human CNS Disorders. Current Genomics. 10, 154-168 (2009).
- Soifer, H. S., Rossi, J. J., Saetrom, P. MicroRNAs in Disease and Potential Therapeutic Applications. Mol Ther. 15, 2070-2079 (2007).
- Bader, A. G., Brown, D., Winkler, M. The Promise of MicroRNA Replacement Therapy. Cancer research. 70, 7027-7030 (2010).
- Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3, 1-17 (2012).
- Trang, P., et al. Systemic Delivery of Tumor Suppressor microRNA Mimics Using a Neutral Lipid Emulsion Inhibits Lung Tumors in Mice. Molecular Therapy. 19, 1116-1122 (2011).
- Barbash, S., Hanin, G., Soreq, H. Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome. J Vis Exp. (76), e50170 (2013).
- Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448, 39-43 (2007).
- Roshan, R., et al. Brain-specific knockdown of miR-29 results in neuronal cell death and ataxia in mice. RNA. 20, 1287-1297 (2014).
- Kaur, H., Wengel, J., Maiti, S. Thermodynamics of DNA−RNA Heteroduplex Formation: Effects of Locked Nucleic Acid Nucleotides Incorporated into the DNA Strand. 生物化学. 47, 1218-1227 (2008).
- Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., Van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34, D140-D144 (2006).
- Kaur, H., Babu, B. R., Maiti, S. Perspectives on Chemistry and Therapeutic Applications of Locked Nucleic Acid (LNA). Chemical Reviews. 107, 4672-4697 (2007).
- Guyenet, S. J., et al. A Simple Composite Phenotype Scoring System for Evaluating Mouse Models of Cerebellar Ataxia. J. Vis. Exp. (39), (2010).
- Bergen, J. M., Park, I. -. K., Horner, P. J., Pun, S. H. Nonviral Approaches for Neuronal Delivery of Nucleic Acids. Pharmaceutical Research. 25, 983-998 (2008).
- Zou, L. -. L., Ma, J. -. L., Wang, T., Yang, T. -. B., Liu, C. -. B. Cell-Penetrating Peptide-Mediated Therapeutic Molecule Delivery into the Central Nervous System. Current Neuropharmacology. 11, 197-208 (2013).
- Hwang, D. W., et al. A brain-targeted rabies virus glycoprotein-disulfide linked PEI nanocarrier for delivery of neurogenic microRNA. Biomaterials. 32, 4968-4975 (2011).
