Uma alternativa simples para injeção estereotáxica para Brain Knockdown específico de miRNA
Summary
MicroRNAs play crucial roles in the brain and are potential targets for modeling neuro-degeneration. However, perturbing miRNA levels is challenging due to the short length of miRNA and inaccessibility of the brain tissue. This video presents a method for antagomir design and brain specific delivery using a neuropeptide in mice.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression. In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the correct expression of microRNAs. Perturbation of microRNAs in the brain can be used to model neurodegenerative diseases by modulating neuronal cell death. Currently, stereotactic injection is used to deliver miRNA knockdown agents to specific location in the brain. Here, we discuss strategies to design antagomirs against miRNA with locked nucleotide modifications (LNA). Subsequently describe a method for brain specific delivery of antagomirs, uniformly across different regions of the brain. This method is simple and widely applicable since it overcomes the surgery, associated injury and limitation of local delivery in stereotactic injections. We prepared a complex of neurotropic, cell-penetrating peptide Rabies Virus Glycoprotein (RVG) with antagomir against miRNA-29 and injected through tail vein, to specifically deliver in the brain. The antagomir design incorporated features that allow specific targeting of the miRNA and formation of non-covalent complexes with the peptide. The knock-down of the miRNA in neuronal cells, resulted in apoptotic cell death and associated behavioural defects. Thus, the method can be used for acute models of neuro-degeneration through the perturbation of miRNAs.
Introduction
MicroRNAs surgiram como novos alvos terapêuticos devido ao seu papel universal na regulação da expressão gênica e evidência direta para o envolvimento na doença. MiRNAs estão sendo ativamente explorados por seu potencial como fármaco atinge 1,2. Além disso, alterações na expressão de miARN estão associados com várias doenças e 3 simulação da variação por perturbação expressão artificial de miARN pode ser usado para estudar as vias celulares envolvidas na manifestação da doença. Entrega específica do tecido de miRNA drogas que alvejam é atualmente um grande desafio para o desenvolvimento de drogas com base miRNA. Antagomirs e imita miARN são agentes promissores para perturbar os níveis de miARN 4-6. No entanto, as características especiais que melhoram a sua especificidade e eficácia tem que ser incorporado no desenho de antagomirs antes que eles possam ser utilizados in vivo para a perturbação da expressão miARN.
Os microRNAs são especialmente relevantes como alvos em neurodegenerativa atualmente incurável e doenças neuro-desenvolvimento. A barreira hemato-encefálica coloca uma restrição para a entrega de antagomirs no cérebro. Injecções estereotáxicas são amplamente utilizados em modelos de roedores para entregar moléculas para locais específicos no cérebro 7. Ele requer habilidade, grandes investimentos na instrumentação e no tempo. Injecções estereotáxicas são invasivos, envolver cirurgia, causar pelo menos lesões menores e são restritas a entrega local. A utilização de péptidos de células de penetração com uma preferência para os neurónios de segmentação pode contrariar estas limitações, uma vez que podem ser entregues por via trans-vascular, mas romper a barreira hemato-encefálica. Tal péptido derivado da glicoproteína do vírus da raiva (RVG), foi previamente utilizado para entregar siRNA contra vírus de encefalite japonesa em ratinhos 8. Descobrimos que utilizando o péptido para antagomir entrega, miRNAs pode ser efetivamente derrubado no cérebro do rato 9.
ontent "> O segundo grande desafio de miRNA knock-down é oriundo da pequena dimensão dos miRNAs ea presença de isoformas de sequências estreitamente relacionadas. Tomamos o exemplo de mmu-miR-29 da família que consiste em três isoformas estreitamente relacionadas, miR-29a , b e c. antagomirs são também geralmente modificado ao longo da espinha dorsal para aumentar a sua estabilidade e torná-las resistentes ao ataque por nucleases. Locked Nucleic Acid (LNAs) oferecem uma vantagem adicional que eles melhoram a estabilidade térmica e mesmo conduzir a alvejar degradação ao longo e para além impedimento estérico 10. Introduzindo modificações ao longo de toda a coluna vertebral pode ser eficaz, mas dispendioso. Temos anteriormente visto que as modificações para além de um número óptimo pode não aumentar ainda mais a eficácia. O desenho do antagomir envolve, por conseguinte, a modificação óptima do antagomir.Para o complexo antagomir de forma não covalente com o péptido neurotrópico, um hepta- carregada para o ramal de nona-arginina é utilizada. D-Argininaresíduos são utilizados, uma vez que conferem uma maior estabilidade, que não são susceptíveis a clivagem por proteases. Hepta para trechos nona-arginina agir agentes celulares penetrante como eficientes, embora eles não conferem especificidade tipo de célula. Por ligação covalente do péptido ao ligante RVG nona-arginina, um neurotrópico, célula penetrando péptido foi gerado. Os resíduos carregados positivamente do péptido interagir com a estrutura de ácido nucleico carregado negativamente, para formar complexos. Estes complexos podem ser utilizados para transfectar eficazmente ADN ou ARN em células em cultura e in vivo para os tecidos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Here we demonstrate a widely accessible methodology to study the effects of miRNA modulation. Currently, most attempts at in vivo characterization of miRNA functions involve the creation of knockout mice or a transgenic that expresses a miRNA sponge. Most miRNAs, even the cell type specific ones are expressed in more than one organ. For instance, miRNAs initially thought to be specific to the hematopoietic system are also expressed in the brain, due to the presence of microglia. Thus even a cell type specifi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Souvik Maiti for help in designing the antagomirs. We also acknowledge Rangeetha J. Naik, Rakesh Dey, and Bijay Pattnaik for their help with experimental methods. This work was funded by the Council of Scientific and Industrial Research (BSC0123). HS, MV and RR acknowledge fellowship from the Council of Scientific and Industrial Research, India. MAS acknowledge fellowship from the University Grants Commission, India.
Materials
| Vortex | |||
| Restrainer or Decapicone | |||
| Narrow runway | ~70-cm-long, ~5-cm-wide with ~5-cm-high walls. | ||
| Reagents | |||
| Fluorescently labelled oligonucleotides (siGLO) | GE Healthcare Dharmacon INC | D0016300120 | |
| 10% sterile D-glucose | |||
| Antagomir-29 | Exiqon | custom synthesis | |
| Antagomir-control | Exiqon | custom synthesis | |
| Neuropeptide RVG | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Neuropeptide RVM | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| 其他 | |||
| Cotton | |||
| Warm water | |||
| Insulin syringes | |||
| Absorbent sheets | |||
| Ink | |||
| Brush | |||
| Antiseptic |
References
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