Una alternativa sencilla para inyección estereotáctica para el Cerebro Derribo específico de miARN
Summary
MicroRNAs play crucial roles in the brain and are potential targets for modeling neuro-degeneration. However, perturbing miRNA levels is challenging due to the short length of miRNA and inaccessibility of the brain tissue. This video presents a method for antagomir design and brain specific delivery using a neuropeptide in mice.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression. In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the correct expression of microRNAs. Perturbation of microRNAs in the brain can be used to model neurodegenerative diseases by modulating neuronal cell death. Currently, stereotactic injection is used to deliver miRNA knockdown agents to specific location in the brain. Here, we discuss strategies to design antagomirs against miRNA with locked nucleotide modifications (LNA). Subsequently describe a method for brain specific delivery of antagomirs, uniformly across different regions of the brain. This method is simple and widely applicable since it overcomes the surgery, associated injury and limitation of local delivery in stereotactic injections. We prepared a complex of neurotropic, cell-penetrating peptide Rabies Virus Glycoprotein (RVG) with antagomir against miRNA-29 and injected through tail vein, to specifically deliver in the brain. The antagomir design incorporated features that allow specific targeting of the miRNA and formation of non-covalent complexes with the peptide. The knock-down of the miRNA in neuronal cells, resulted in apoptotic cell death and associated behavioural defects. Thus, the method can be used for acute models of neuro-degeneration through the perturbation of miRNAs.
Introduction
Los microARNs se han convertido en nuevas dianas terapéuticas debido a su papel universal en la regulación de la expresión génica y pruebas directas de la participación en la enfermedad. MiRNAs se están explorando activamente por su potencial como fármaco dirigido a 1,2. Además, alteraciones en la expresión de los genes miARN están asociados con varias enfermedades 3 y simulación de estos cambios por la perturbación artificial de expresión de los genes miARN se puede utilizar para estudiar las vías celulares implicadas en la manifestación de la enfermedad. Entrega específica de tejido de miARN fármacos dirigidos es actualmente un gran desafío para el desarrollo de fármacos basados miARN. Antagomirs e imita miARN son agentes prometedores para perturbar los niveles de miRNA 4-6. Sin embargo, las características especiales que mejoran su especificidad y eficacia tienen que ser incorporado en el diseño de antagomirs antes de que puedan ser utilizados para la perturbación in vivo de la expresión de los genes miARN.
Los microARN son especialmente relevantes como objetivos en neurodegenerativa actualmente incurable y enfermedades del neurodesarrollo. La barrera sangre-cerebro plantea una restricción a la entrega de antagomirs en el cerebro. Inyecciones estereotácticas son ampliamente utilizados en modelos de roedores para entregar moléculas a lugares específicos en el cerebro 7. Se requiere habilidad, amplia inversión en instrumentación y el tiempo. Inyecciones estereotáxicas son invasivas, implica cirugía, causar al menos leve lesión y se limita a la entrega local. El uso de péptidos penetrantes de células con una preferencia por las neuronas de orientación puede contrarrestar estas limitaciones, ya que pueden ser entregados a través de la ruta trans-vascular, pero romper la barrera hematoencefálica. Tal péptido derivado de la rabia Virus de la glucoproteína (RVG), se utilizó previamente para entregar siRNA contra virus de encefalitis japonesa en ratones 8. Encontramos que el uso del péptido para antagomir entrega, miRNAs puede ser efectivamente derribado en el cerebro del ratón 9.
ontenido "> El segundo gran reto de miARN knock-down surge desde el pequeño tamaño de miRNAs y la presencia de isoformas de secuencias estrechamente relacionadas. Tomamos el ejemplo de la MMU-miR-29 familiar que consta de tres isoformas estrechamente relacionados, miR-29a , b y c. antagomirs son también en general modificada a lo largo de la columna vertebral para aumentar su estabilidad y hacerlas resistentes al ataque de nucleasas. Locked Nucleic Acids (LNA) ofrecen una ventaja adicional que mejoran la estabilidad térmica e incluso conducir a la degradación orientar sobre y más allá impedimento estérico 10. La introducción de modificaciones a lo largo de la columna vertebral puede ser eficaz, pero caro. Hemos visto anteriormente que las modificaciones más allá de un número óptimo pueden no mejorar aún más la eficacia. El diseño de la antagomir por lo tanto, implica la modificación óptima de la antagomir.Para antagomir complejo no covalente con el péptido neurotrópico, un hepta- cargada a la extensión nona-arginina se utiliza el. D-argininaresiduos se utilizan ya que confieren mayor estabilidad ya que no son susceptibles a la escisión por proteasas. Hepta a estiramientos-nona arginina actúan agentes celulares penetrante como eficientes, a pesar de que no confieren especificidad de tipo celular. Al enlazar covalentemente el péptido RVG al enlazador nona-arginina, un neurotrópico, péptido celular penetrante se generó. Los residuos cargados positivamente del péptido interactúan con la columna vertebral de ácido nucleico cargado negativamente, para formar complejos. Estos complejos se pueden utilizar para transfectar eficazmente ADN o ARN en células cultivadas e in vivo en los tejidos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Here we demonstrate a widely accessible methodology to study the effects of miRNA modulation. Currently, most attempts at in vivo characterization of miRNA functions involve the creation of knockout mice or a transgenic that expresses a miRNA sponge. Most miRNAs, even the cell type specific ones are expressed in more than one organ. For instance, miRNAs initially thought to be specific to the hematopoietic system are also expressed in the brain, due to the presence of microglia. Thus even a cell type specifi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Souvik Maiti for help in designing the antagomirs. We also acknowledge Rangeetha J. Naik, Rakesh Dey, and Bijay Pattnaik for their help with experimental methods. This work was funded by the Council of Scientific and Industrial Research (BSC0123). HS, MV and RR acknowledge fellowship from the Council of Scientific and Industrial Research, India. MAS acknowledge fellowship from the University Grants Commission, India.
Materials
| Vortex | |||
| Restrainer or Decapicone | |||
| Narrow runway | ~70-cm-long, ~5-cm-wide with ~5-cm-high walls. | ||
| Reagents | |||
| Fluorescently labelled oligonucleotides (siGLO) | GE Healthcare Dharmacon INC | D0016300120 | |
| 10% sterile D-glucose | |||
| Antagomir-29 | Exiqon | custom synthesis | |
| Antagomir-control | Exiqon | custom synthesis | |
| Neuropeptide RVG | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Neuropeptide RVM | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| 其他 | |||
| Cotton | |||
| Warm water | |||
| Insulin syringes | |||
| Absorbent sheets | |||
| Ink | |||
| Brush | |||
| Antiseptic |
References
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