شريط الفحص لدراسة آخر جذاب أو مثيرة للاشمئزاز من الركيزة البروتين عن طريق فصل الخلايا العصبية الحصين
Summary
Axon guidance molecules regulate neuronal migration and targeted growth-cone navigation. We present a powerful method, the stripe assay, to assess the ability of guidance molecules to attract or repulse neurons. In this protocol, we demonstrate the stripe assay by showing FLRT2’s ability to repel cultured hippocampal neurons.
Abstract
Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to navigate axonal growth. Netrin, slit, semaphorin, and ephrins are known guidance molecules that can attract or repel axons upon binding to receptors and co-receptors on the axon. The activated receptors initiate various signaling molecules in the growth cone that alter the structure and movement of the neuron. Here, we describe the detailed protocol for a stripe assay to assess the ability of a guidance molecule to attract or repel neurons. In this method, dissociated hippocampal neurons from E15.5 mice are cultured on laminin-coated dishes processed with alternating stripes of ectodomain of fibronectin and leucine-rich transmembrane protein-2 (FLRT2) and control immunoglobulin G (IgG) fragment crystallizable region (Fc) protein. Both axons and cell bodies were strongly repelled from the FLRT2-coated stripe regions after 24 h of culture. Immunostaining with tau1 showed that ~90% of the neurons were distributed on the Fc-coated stripes compared to the FLRT2-Fc-coated stripes (~10%). This result indicates that FLRT2 has a strong repulsive effect on these neurons. This powerful method is applicable not only for primary cultured neurons but also for a variety of other cells, such as neuroblasts.
Introduction
التوجيه محور عصبي هو العملية التي من خلالها الخلايا العصبية التي شكلت حديثا إرسال المحاور الى هدفهم خلال تطوير 1،2 الجهاز العصبي. محاور تطوير تحمل بنية متحركة غاية في غيض التي تسمى مخروط النمو. مخروط النمو الحواس العظة خارج الخلية للتنقل مسار محور عصبي و. جزيئات التوجيه، مثل شق، semaphorin، وephrins، يمكن أن تجتذب أو صد المحاور اعتمادا على تفاعلها مع مستقبلات مناسبة وشارك في المستقبلات على محور عصبي 1،3،4. المستقبلات تنشيط نقل إشارات إلى مخروط النمو التي تؤثر على تنظيم هيكل الخلية من أجل الحركات محور عصبي والنمو مخروط.
وقد وضعت أساليب مختلفة لتقييم عمل جاذبة وطاردة الجزيئات. الكيماوي جاذبة، طارد الحشرات يمكن أن تدار في المتوسط نمو / الثقافة مع التركيز التدرج (على سبيل المثال، غرفة دان أو الشرائح ميكرون) 5،6، في بقعة عالية التركيز من قبل ف الصغير ipette (على سبيل المثال، تحول فحص) 7 أو بتركيز متجانسة من خلال تطبيق الحمام (على سبيل المثال، مخروط النمو انهيار فحص) 8،9.
وتشمل الأساليب الأخرى لفحص شريط أو microcontact الطباعة (μCP)، حيث يتم المغلفة لالكيماوي جاذبة أو طاردة على سطح لوحة باعتبارها الركيزة 10-12. وقد وضعت Thestripe فحص أصلا بونهوفر وزملاؤه في عام 1987 لتحليل رسم الخرائط الطوبوغرافية في فرخ نظام retino-سقفي 13. طريقة الأصلي يتطلب نظام فراغ للبروتينات معطف على الأغشية nucleopore البولي باستخدام مخطط والمصفوفات مزجها. في إصدارات لاحقة، وطبعت البروتينات المؤتلف مباشرة على سطح لوحة الثقافة في نمط شريطية باستخدام فتحة ضيقة المصفوفات السيليكون 14،15. في الآونة الأخيرة، وقد طبقت المجموعات البحثية المختلفة بنجاح هذا شريط الاختبار لتحليل الأنشطة جزيء التوجيه محور عصبي 16-21.
<p class = "jove_content"> وهنا نقدم بروتوكول مفصل لفحص الشريط الذي يقيس جذب أو تنافر الجزيئات التوجيه محور عصبي للخلايا العصبية الحصين فصلها. والجدير بالذكر، يمكن تطبيق هذا الأسلوب في بيئة معملية مجهزة الحد الأدنى. لهذا الاختبار، يتم إنشاء المشارب بالتناوب من ركيزة fluorescently المسمى والبروتين السيطرة على طبق من البلاستيك باستخدام مصفوفة السيليكون مع الشقوق 90 ميكرومتر والمغلفة مع laminin. في مظاهرة لدينا، نأت كانت الخلايا العصبية قرن آمون من الفئران E15.5 مثقف على بالتناوب المشارب من ectodomain المؤتلف من فبرونيكتين ويسين الغنية بالبروتين 2 الغشاء (FLRT2) والسيطرة على البروتين التيسير 21. بعد 24 ساعة من الثقافة، كل من المحاور والهيئات خلية من الخلايا العصبية نفرت بشدة من المشارب FLRT2. تلطيخ مع الأجسام المضادة لمكافحة Tau1 كشفت أن ~ تم توزيع 90٪ من الخلايا العصبية في المناطق المغلفة التيسير، مقارنة ب ~ 10٪ على FLRT2-FC، مشيرا إلى أن FLRT2 ديه مثير للاشمئزاز قويوظيفة للعصبونات الحصين 21.Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول فحص شريط يستخدم البروتين المؤتلف والخلايا العصبية فصلها عن الحصين E15.5 الماوس. هذا الاختبار يسمح للمراقبة فعالة من ردود مثير للاشمئزاز، جذابة، أو محايدة من الخلايا العصبية إلى البروتين المؤتلف من الاهتمام وضعت في نمط شريطية. والميزة الرئيسية لهذا …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Grants-in-Aid for Scientific Research from the Japan Society for the Promotion of Science (23700412, 25122707 and 26670090 to S.Y.).
Materials
| 15 mL centrifuge tube | Violamo | 1-3500-01 | |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Nacalai | 01954-85 | |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-human IgG antibody | Thermo Scientific | A11013 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-mouse IgG antibody | Thermo Scientific | A-21203 | Dilution 1/500 |
| Anti-Tau1 antibody | Chemicon | MAB3420 | Dilution 1/200 |
| Antifade | Thermo Scientific | P7481 | Alternative mounting media may be used |
| B27 supplement | Thermo Scientific | 17504-044 | Dilution 1/50 |
| Bovine serum albumin | Sigma | 01-2030-2 | |
| Cell strainer 100 um | BD Falcon | 352360 | |
| Centrifugation machine | Kubota | 2410 | |
| Cover glass 18mmx18mm | Matsunami | 18×18 mm No. 1 | |
| DAKO pen | DAKO | S2002 | Alternative water-repellent pen may be used |
| Disposable scalpel | Feather | 2975#11 | |
| FBS | Thermo Scientific | 10437-028 | |
| Fluorecent microscope | Nikon | E600 | |
| Forceps No. 5 | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| GlutaMAX | Thermo Scientific | 35050-061 | Dilution 1/200 |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 805N | 22 gauge, 50 uL |
| HBSS | Thermo Scientific | 14170-112 | |
| Human IgG, Fc Fragment | Jackson | 009-000-008 | |
| Laminin | Thermo Scientific | 23017-015 | |
| Neurobasal | Thermo Scientific | 21103-049 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson | 017-000-121 | |
| PBS | Nacalai | 14249-24 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15070-063 | Dilution 1/100 |
| Plastic culture dish, 60 mm | Thermo Scientific | 150288 | |
| Silicone Matrices | Available and purchasable from Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu) | ||
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Tip, 1000 uL | Watson | 125-1000S | |
| Transparent sticky tape | Tesa | 57315 | Alternative sticky tape may be used |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Trypan blue, 0.4% | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Trypsin/EDTA | Thermo Scientific | 25300-054 | |
| Culture medium | Neurobasal supplemented with B27, GlutaMAX and Penicillin-Streptomycin. |
References
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Bashaw, G. J., Klein, R. Signaling from axon guidance receptors. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (5), 001941 (2010).
- Hong, K., Nishiyama, M., Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Poo, M. Calcium signalling in the guidance of nerve growth by netrin-1. Nature. 403 (6765), 93-98 (2000).
- Ming, G. -. l., Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Song, H. -. j., Poo, M. -. m. Electrical Activity Modulates Growth Cone Guidance by Diffusible Factors. Neuron. 29 (2), 441-452 (2001).
- Dudanova, I., et al. Genetic evidence for a contribution of EphA:ephrinA reverse signaling to motor axon guidance. J Neurosci. 32 (15), 5209-5215 (2012).
- Ye, B. Q., Geng, Z. H., Ma, L., Geng, J. G. Slit2 regulates attractive eosinophil and repulsive neutrophil chemotaxis through differential srGAP1 expression during lung inflammation. J Immunol. 185 (10), 6294-6305 (2010).
- Ly, A., et al. DSCAM is a netrin receptor that collaborates with DCC in mediating turning responses to netrin-1. Cell. 133 (7), 1241-1254 (2008).
- Hata, K., Kaibuchi, K., Inagaki, S., Yamashita, T. Unc5B associates with LARG to mediate the action of repulsive guidance molecule. J Cell Biol. 184 (5), 737-750 (2009).
- Egea, J., et al. Regulation of EphA 4 kinase activity is required for a subset of axon guidance decisions suggesting a key role for receptor clustering in Eph function. Neuron. 47 (4), 515-528 (2005).
- von Philipsborn, A. C., Lang, S., Jiang, Z., Bonhoeffer, F., Bastmeyer, M. Substrate-Bound Protein Gradients for Cell Culture Fabricated by Microfluidic Networks and Microcontact Printing. Sci Signal. , (2007).
- Jackman, R., Wilbur, J., Whitesides, G. Fabrication of submicrometer features on curved substrates by microcontact printing. Science. 269 (5224), 664-666 (1995).
- Mrksich, M., Whitesides, G. M. Using self-assembled monolayers to understand the interactions of man-made surfaces with proteins and cells. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 25, 55-78 (1996).
- Walter, J., Kern-Veits, B., Huf, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F. Recognition of position-specific properties of tectai cell membranes by retinal axons in vitro. Development. 101, 685-696 (1987).
- Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nat Protoc. 2 (5), 1216-1224 (2007).
- Weschenfelder, M., Weth, F., Knoll, B., Bastmeyer, M. The stripe assay: studying growth preference and axon guidance on binary choice substrates in vitro. Methods Mol Biol. 1018, 229-246 (2013).
- Seiradake, E., et al. Structure and functional relevance of the Slit2 homodimerization domain. EMBO Rep. 10 (7), 736-741 (2009).
- Gebhardt, C., Bastmeyer, M., Weth, F. Balancing of ephrin/Eph forward and reverse signaling as the driving force of adaptive topographic mapping. Development. 139 (2), 335-345 (2012).
- Atapattu, L., et al. Antibodies binding the ADAM10 substrate recognition domain inhibit Eph function. J Cell Sci. 125, 6084-6093 (2012).
- Stark, D. A., Karvas, R. M., Siegel, A. L., Cornelison, D. D. Eph/ephrin interactions modulate muscle satellite cell motility and patterning. Development. 138 (24), 5279-5289 (2011).
- Seiradake, E., et al. FLRT Structure: Balancing Repulsion and Cell Adhesion in Cortical and Vascular Development. Neuron. 84 (2), 370-385 (2014).
- Yamagishi, S., et al. FLRT2 and FLRT3 act as repulsive guidance cues for Unc5-positive neurons. EMBO J. 30 (14), 2920-2933 (2011).
