Stripe Assay לחקר פעילות דוחה או מושך של מצע חלבון באמצעות ניתק נוירונים בהיפוקמפוס
Summary
Axon guidance molecules regulate neuronal migration and targeted growth-cone navigation. We present a powerful method, the stripe assay, to assess the ability of guidance molecules to attract or repulse neurons. In this protocol, we demonstrate the stripe assay by showing FLRT2’s ability to repel cultured hippocampal neurons.
Abstract
Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to navigate axonal growth. Netrin, slit, semaphorin, and ephrins are known guidance molecules that can attract or repel axons upon binding to receptors and co-receptors on the axon. The activated receptors initiate various signaling molecules in the growth cone that alter the structure and movement of the neuron. Here, we describe the detailed protocol for a stripe assay to assess the ability of a guidance molecule to attract or repel neurons. In this method, dissociated hippocampal neurons from E15.5 mice are cultured on laminin-coated dishes processed with alternating stripes of ectodomain of fibronectin and leucine-rich transmembrane protein-2 (FLRT2) and control immunoglobulin G (IgG) fragment crystallizable region (Fc) protein. Both axons and cell bodies were strongly repelled from the FLRT2-coated stripe regions after 24 h of culture. Immunostaining with tau1 showed that ~90% of the neurons were distributed on the Fc-coated stripes compared to the FLRT2-Fc-coated stripes (~10%). This result indicates that FLRT2 has a strong repulsive effect on these neurons. This powerful method is applicable not only for primary cultured neurons but also for a variety of other cells, such as neuroblasts.
Introduction
הדרכת האקסון היא התהליך שבו הנוירונים שהוקם זה עתה לשלוח אקסונים אל היעד שלהם במהלך פיתוח של 1,2 מערכת העצבים. אקסונים פיתוח לשאת מבנה ניע מאוד בקצהו שלהם שנקרא חרוט צמיחה. חרוט הצמיחה החושים רמזים תאיים לנתב את הדרך של האקסון. מולקולות הנחיה, כגון חתך, semaphorin, ו ephrins, יכולים למשוך או לדחות אקסונים תלוי האינטראקציה שלהם עם קולטנים מתאימים-קולטנים שיתוף על האקסון 1,3,4. הקולטנים מופעלים להעביר אותות אל חרוט הצמיחה המשפיעים ארגון cytoskeletal שלה לתנועות האקסון וצמיחה חרוטה.
שיטות שונות פותחו כדי להעריך את הפעולה של מולקולות attractant ודוחה. חמו-משיכה ודוחים יכול להינתן לתוך מדיום הגידול / תרבות עם ריכוז שיפוע (למשל., קאמרית או μ-מגלשות דאן) 5,6, במקום מרוכז מאוד על ידי מיקרו-p ipette (למשל., assay מפנה) 7 או בריכוז הומוגנית ידי יישום אמבטיה (למשל., assay קריסת צמיחה חרוט) 8,9.
שיטות אחרות כוללות assay פס או הדפסת microcontact (μCP), שבו attractant הכימותרפיה או דוחה מצופה על פני השטח של צלחת כמו מצע 10-12. Thestripe assay פותחה במקור על ידי בונהופר ועמיתיו בשנת 1987 לנתח מיפוי טופוגרפי במערכת retino-tectal חומוס 13. השיטה המקורית נדרש שואב אבק לחלבונים מעיל על ממברנות פוליקרבונט nucleopore באמצעות פסים ומטריצות מרושת. בגירסאות מתקדמות יותר, חלבונים רקומביננטיים הודפסו ישירות על פני השטח של צלחת תרבות בדפוס פסים באמצעות 14,15 מטריצות סיליקון פתח צר. לאחרונה, קבוצות מחקר שונות יישמו בהצלחה assay פס זה ניתוח של פעילות מולקולה הדרכה האקסון 16-21.
<p class = "jove_content"> כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור assay פס המודד את למשיכה או לדחיה של מולקולות האקסון הדרכה עבור נוירונים בהיפוקמפוס ניתק. יש לציין, שיטה זו יכולה להיות מיושמת במסגרות מעבדה מצוידות מינימאלי. עבור assay זה, פסים מתחלפים של מצע שכותרתו fluorescently ו חלבון בקרה מופקים על צלחת פלסטיק באמצעות מטריצת סיליקון עם חריצי 90 מיקרומטר ומצופי laminin. בהפגנה שלנו, ניתק נוירונים בהיפוקמפוס מעכברים E15.5 היו בתרבית על לסירוגין פסים של ectodomain רקומביננטי של פיברונקטין ו לאוצין עשיר הטרנסממברני חלבון-2 (FLRT2) ולשלוט Fc חלבון 21. לאחר 24 שעות של תרבות, הן אקסונים גופי התא של הנוירונים נהדפו מאוד מן פסים FLRT2. צביעה עם נוגדן אנטי Tau1 גילה כי כ -90% של נוירונים חולקו על אזורים מצופה Fc, לעומת כ -10% על FLRT2-FC, המציין כי FLRT2 יש חזקה דוחהפונקציה עבור נוירונים בהיפוקמפוס 21.Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר assay פס המשתמשת חלבון רקומביננטי נוירונים ניתק מן ההיפוקמפוס עכבר E15.5. assay זה מאפשר תצפית היעילה של תגובות דוחות, אטרקטיביות, או ניטראליות של נוירונים לחלבון רקומביננטי של עניין להציב דפוס פסים. יתרון עיקרי של פרוטוקול זה הוא השיטה הפשוטה ליצירת הפסים,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Grants-in-Aid for Scientific Research from the Japan Society for the Promotion of Science (23700412, 25122707 and 26670090 to S.Y.).
Materials
| 15 mL centrifuge tube | Violamo | 1-3500-01 | |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Nacalai | 01954-85 | |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-human IgG antibody | Thermo Scientific | A11013 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-mouse IgG antibody | Thermo Scientific | A-21203 | Dilution 1/500 |
| Anti-Tau1 antibody | Chemicon | MAB3420 | Dilution 1/200 |
| Antifade | Thermo Scientific | P7481 | Alternative mounting media may be used |
| B27 supplement | Thermo Scientific | 17504-044 | Dilution 1/50 |
| Bovine serum albumin | Sigma | 01-2030-2 | |
| Cell strainer 100 um | BD Falcon | 352360 | |
| Centrifugation machine | Kubota | 2410 | |
| Cover glass 18mmx18mm | Matsunami | 18×18 mm No. 1 | |
| DAKO pen | DAKO | S2002 | Alternative water-repellent pen may be used |
| Disposable scalpel | Feather | 2975#11 | |
| FBS | Thermo Scientific | 10437-028 | |
| Fluorecent microscope | Nikon | E600 | |
| Forceps No. 5 | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| GlutaMAX | Thermo Scientific | 35050-061 | Dilution 1/200 |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 805N | 22 gauge, 50 uL |
| HBSS | Thermo Scientific | 14170-112 | |
| Human IgG, Fc Fragment | Jackson | 009-000-008 | |
| Laminin | Thermo Scientific | 23017-015 | |
| Neurobasal | Thermo Scientific | 21103-049 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson | 017-000-121 | |
| PBS | Nacalai | 14249-24 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15070-063 | Dilution 1/100 |
| Plastic culture dish, 60 mm | Thermo Scientific | 150288 | |
| Silicone Matrices | Available and purchasable from Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu) | ||
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Tip, 1000 uL | Watson | 125-1000S | |
| Transparent sticky tape | Tesa | 57315 | Alternative sticky tape may be used |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Trypan blue, 0.4% | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Trypsin/EDTA | Thermo Scientific | 25300-054 | |
| Culture medium | Neurobasal supplemented with B27, GlutaMAX and Penicillin-Streptomycin. |
References
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Bashaw, G. J., Klein, R. Signaling from axon guidance receptors. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (5), 001941 (2010).
- Hong, K., Nishiyama, M., Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Poo, M. Calcium signalling in the guidance of nerve growth by netrin-1. Nature. 403 (6765), 93-98 (2000).
- Ming, G. -. l., Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Song, H. -. j., Poo, M. -. m. Electrical Activity Modulates Growth Cone Guidance by Diffusible Factors. Neuron. 29 (2), 441-452 (2001).
- Dudanova, I., et al. Genetic evidence for a contribution of EphA:ephrinA reverse signaling to motor axon guidance. J Neurosci. 32 (15), 5209-5215 (2012).
- Ye, B. Q., Geng, Z. H., Ma, L., Geng, J. G. Slit2 regulates attractive eosinophil and repulsive neutrophil chemotaxis through differential srGAP1 expression during lung inflammation. J Immunol. 185 (10), 6294-6305 (2010).
- Ly, A., et al. DSCAM is a netrin receptor that collaborates with DCC in mediating turning responses to netrin-1. Cell. 133 (7), 1241-1254 (2008).
- Hata, K., Kaibuchi, K., Inagaki, S., Yamashita, T. Unc5B associates with LARG to mediate the action of repulsive guidance molecule. J Cell Biol. 184 (5), 737-750 (2009).
- Egea, J., et al. Regulation of EphA 4 kinase activity is required for a subset of axon guidance decisions suggesting a key role for receptor clustering in Eph function. Neuron. 47 (4), 515-528 (2005).
- von Philipsborn, A. C., Lang, S., Jiang, Z., Bonhoeffer, F., Bastmeyer, M. Substrate-Bound Protein Gradients for Cell Culture Fabricated by Microfluidic Networks and Microcontact Printing. Sci Signal. , (2007).
- Jackman, R., Wilbur, J., Whitesides, G. Fabrication of submicrometer features on curved substrates by microcontact printing. Science. 269 (5224), 664-666 (1995).
- Mrksich, M., Whitesides, G. M. Using self-assembled monolayers to understand the interactions of man-made surfaces with proteins and cells. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 25, 55-78 (1996).
- Walter, J., Kern-Veits, B., Huf, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F. Recognition of position-specific properties of tectai cell membranes by retinal axons in vitro. Development. 101, 685-696 (1987).
- Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nat Protoc. 2 (5), 1216-1224 (2007).
- Weschenfelder, M., Weth, F., Knoll, B., Bastmeyer, M. The stripe assay: studying growth preference and axon guidance on binary choice substrates in vitro. Methods Mol Biol. 1018, 229-246 (2013).
- Seiradake, E., et al. Structure and functional relevance of the Slit2 homodimerization domain. EMBO Rep. 10 (7), 736-741 (2009).
- Gebhardt, C., Bastmeyer, M., Weth, F. Balancing of ephrin/Eph forward and reverse signaling as the driving force of adaptive topographic mapping. Development. 139 (2), 335-345 (2012).
- Atapattu, L., et al. Antibodies binding the ADAM10 substrate recognition domain inhibit Eph function. J Cell Sci. 125, 6084-6093 (2012).
- Stark, D. A., Karvas, R. M., Siegel, A. L., Cornelison, D. D. Eph/ephrin interactions modulate muscle satellite cell motility and patterning. Development. 138 (24), 5279-5289 (2011).
- Seiradake, E., et al. FLRT Structure: Balancing Repulsion and Cell Adhesion in Cortical and Vascular Development. Neuron. 84 (2), 370-385 (2014).
- Yamagishi, S., et al. FLRT2 and FLRT3 act as repulsive guidance cues for Unc5-positive neurons. EMBO J. 30 (14), 2920-2933 (2011).
