Stripe Assay pour étudier l'activité attractive ou répulsive d'un substrat protéique utilisant dissociées hippocampique Neurones

Summary

Axon guidance molecules regulate neuronal migration and targeted growth-cone navigation. We present a powerful method, the stripe assay, to assess the ability of guidance molecules to attract or repulse neurons. In this protocol, we demonstrate the stripe assay by showing FLRT2’s ability to repel cultured hippocampal neurons.

Abstract

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to navigate axonal growth. Netrin, slit, semaphorin, and ephrins are known guidance molecules that can attract or repel axons upon binding to receptors and co-receptors on the axon. The activated receptors initiate various signaling molecules in the growth cone that alter the structure and movement of the neuron. Here, we describe the detailed protocol for a stripe assay to assess the ability of a guidance molecule to attract or repel neurons. In this method, dissociated hippocampal neurons from E15.5 mice are cultured on laminin-coated dishes processed with alternating stripes of ectodomain of fibronectin and leucine-rich transmembrane protein-2 (FLRT2) and control immunoglobulin G (IgG) fragment crystallizable region (Fc) protein. Both axons and cell bodies were strongly repelled from the FLRT2-coated stripe regions after 24 h of culture. Immunostaining with tau1 showed that ~90% of the neurons were distributed on the Fc-coated stripes compared to the FLRT2-Fc-coated stripes (~10%). This result indicates that FLRT2 has a strong repulsive effect on these neurons. This powerful method is applicable not only for primary cultured neurons but also for a variety of other cells, such as neuroblasts.

Introduction

L' orientation Axon est le processus par lequel les neurones nouvellement formés envoient des axones à leur cible au cours du développement du système nerveux ^1,2. axones en développement portent une structure très mobiles à leur extrémité appelée cône de croissance. Le cône de croissance détecte les signaux extracellulaires pour naviguer le chemin de l'axone. Molécules d'orientation, telles que fente, sémaphorine et ephrines, peuvent attirer ou repousser les axones en fonction de leur interaction avec des récepteurs appropriés et co-récepteurs sur l'axone ^1,3,4. Les récepteurs activés transfèrent des signaux au cône de croissance qui affectent son organisation du cytosquelette pour axone et la croissance cône mouvements.

Diverses méthodes ont été mises au point pour évaluer l'action des molécules répulsives et attractives. Chemo-attractants et insectifuges peuvent être administrés dans le milieu de croissance / culture avec une concentration de gradient (par exemple., La chambre de Dunn ou u-slides) ^5,6, dans un endroit très concentré par des micro-pipette (par exemple., essai tournant) ⁷ ou à une concentration homogène par application de bain (par ex., le dosage de l' effondrement du cône de croissance) ^8,9.

D' autres procédés comprennent un essai de rayure ou de l' impression par microcontact (uCP), dans lequel un chimio-attractant ou répulsive est appliquée sur la surface d'une plaque de substrat ^{10 à 12.} Thestripe essai a été initialement développé par Bonhoeffer et ses collègues en 1987 pour analyser la cartographie topographique dans le poussin système rétino-tectal ^13. La méthode originale nécessitait un système de vide pour des protéines d'enveloppe sur des membranes Nucleopore polycarbonate en utilisant des matrices et des rayures maillés. Dans les versions ultérieures, les protéines recombinantes ont été imprimées directement sur ​​la surface d'une plaque de culture dans un motif rayé en utilisant fente étroite matrices de silicium ^14,15. Récemment, divers groupes de recherche ont appliqué avec succès ce test de bande à l'analyse des activités de molécules de guidage axonal ^16-21.

<p class = "jove_content"> Ici, nous présentons le protocole détaillé pour un essai de bande qui mesure l'attraction ou la répulsion des molécules de guidage axonal pour les neurones hippocampiques dissociées. En particulier, cette méthode peut être appliquée dans des conditions de laboratoire très peu équipés. Pour ce dosage, des bandes alternées d'un substrat marqué de manière fluorescente et une protéine de contrôle sont générés sur une boîte en matière plastique en utilisant une matrice de silicium avec des fentes 90 um et recouvertes de laminine. Dans notre démonstration, dissociées les neurones hippocampiques de souris E15.5 ont été cultivées sur des bandes de ectodomaine recombinant de la fibronectine et la leucine-riche en protéines 2 transmembranaire (FLRT2) et le contrôle de la protéine Fc ²¹ alternance. Après 24 h de la culture, à la fois les axones et les corps cellulaires des neurones ont été fortement repoussés par les bandes de FLRT2. Coloration avec un anticorps anti-Tau1 ~ a révélé que 90% des neurones ont été distribués sur les régions Fc revêtues, par rapport à environ 10% sur la FLRT2-Fc, ce qui indique que FLRT2 a une forte répulsionfonction pour les neurones hippocampiques ^21.

Protocol

Les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés par le Comité soin et l'utilisation institutionnelle des animaux à l'École de médecine de l'Université Hamamatsu. 1. Préparation des matrices Faire bouillir 4-8 matrices de silicone dans un micro-ondes ou sur une plaque chauffante pendant 5 minutes et laissez-les sécher complètement pendant 1 h sous flux laminaire (côté rayé vers le haut). Remarque: Les procédures suivantes doivent être effectuées sous …

Representative Results

Neurones hippocampiques dissociées de souris E15.5 ont été étalées et cultivées pendant 24 h sur des bandes de contrôle marquées par fluorescence Fc (figure 3A-C) ou FLRT2-Fc (Figure 3D-F) en alternance avec Fc non marqué contrôle. Dans les deux cas, les neurones ont été agrégées et ont étendu leurs axones sous forme de faisceaux. Sur le contrôle des bandes Fc / Fc, les neurones ont été distribués uniformément sur ​​les bandes mar…

Discussion

Ce protocole décrit un test de bande qui utilise une protéine recombinante et les neurones dissociés de l'hippocampe de souris E15.5. Ce dosage permet d'observer l'efficacité des réactions de répulsion, attirant ou neutre de neurones à une protéine recombinante d'intérêt placé dans un motif rayé. Un avantage majeur de ce protocole est le procédé simple pour produire des bandes, dans lequel la protéine est directement imprimée sur la surface d'une boîte en matière plastique, par rapp…

Materials

15 mL centrifuge tube	Violamo	1-3500-01
4% Paraformaldehyde (PFA)	Nacalai	01954-85
Alexa Fluor 488 Goat anti-human IgG antibody	Thermo Scientific	A11013
Alexa Fluor 594 Donkey anti-mouse IgG antibody	Thermo Scientific	A-21203	Dilution 1/500
Anti-Tau1 antibody	Chemicon	MAB3420	Dilution 1/200
Antifade	Thermo Scientific	P7481	Alternative mounting media may be used
B27 supplement	Thermo Scientific	17504-044	Dilution 1/50
Bovine serum albumin	Sigma	01-2030-2
Cell strainer 100 um	BD Falcon	352360
Centrifugation machine	Kubota	2410
Cover glass 18mmx18mm	Matsunami	18×18 mm No. 1
DAKO pen	DAKO	S2002	Alternative water-repellent pen may be used
Disposable scalpel	Feather	2975#11
FBS	Thermo Scientific	10437-028
Fluorecent microscope	Nikon	E600
Forceps No. 5	Fine Science Tools	11254-20
GlutaMAX	Thermo Scientific	35050-061	Dilution 1/200
Hamilton Syringe	Hamilton	805N	22 gauge, 50 uL
HBSS	Thermo Scientific	14170-112
Human IgG, Fc Fragment	Jackson	009-000-008
Laminin	Thermo Scientific	23017-015
Neurobasal	Thermo Scientific	21103-049
Normal Donkey Serum	Jackson	017-000-121
PBS	Nacalai	14249-24
Penicillin-Streptomycin	Thermo Scientific	15070-063	Dilution 1/100
Plastic culture dish, 60 mm	Thermo Scientific	150288
Silicone Matrices			Available and purchasable from Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu)
Stereo Microscope	Olympus	SZ61
Tip, 1000 uL	Watson	125-1000S
Transparent sticky tape	Tesa	57315	Alternative sticky tape may be used
Triton X-100	Sigma	T8787
Trypan blue, 0.4%	Bio-Rad	145-0013
Trypsin/EDTA	Thermo Scientific	25300-054
Culture medium			Neurobasal supplemented with B27, GlutaMAX and Penicillin-Streptomycin.