스트라이프 분석은 해리 해마 신경 세포를 사용하여 단백질 기판의 매력적인 또는 혐오감 활동을 연구하는
Summary
Axon guidance molecules regulate neuronal migration and targeted growth-cone navigation. We present a powerful method, the stripe assay, to assess the ability of guidance molecules to attract or repulse neurons. In this protocol, we demonstrate the stripe assay by showing FLRT2’s ability to repel cultured hippocampal neurons.
Abstract
Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to navigate axonal growth. Netrin, slit, semaphorin, and ephrins are known guidance molecules that can attract or repel axons upon binding to receptors and co-receptors on the axon. The activated receptors initiate various signaling molecules in the growth cone that alter the structure and movement of the neuron. Here, we describe the detailed protocol for a stripe assay to assess the ability of a guidance molecule to attract or repel neurons. In this method, dissociated hippocampal neurons from E15.5 mice are cultured on laminin-coated dishes processed with alternating stripes of ectodomain of fibronectin and leucine-rich transmembrane protein-2 (FLRT2) and control immunoglobulin G (IgG) fragment crystallizable region (Fc) protein. Both axons and cell bodies were strongly repelled from the FLRT2-coated stripe regions after 24 h of culture. Immunostaining with tau1 showed that ~90% of the neurons were distributed on the Fc-coated stripes compared to the FLRT2-Fc-coated stripes (~10%). This result indicates that FLRT2 has a strong repulsive effect on these neurons. This powerful method is applicable not only for primary cultured neurons but also for a variety of other cells, such as neuroblasts.
Introduction
축삭지도는 새로 형성된 신경 세포는 신경계의 1, 2의 개발 기간 동안 자신의 목표에 축삭를 전송하는 과정입니다. 개발 축삭의 성장 원추라는 자신의 끝에 높은 운동성 구조를 실시하고 있습니다. 성장 콘 축삭의 경로를 탐색하는 세포 외 신호를 감지한다. 안내 등의 슬릿, semaphorin 같은 분자 및 ephrins는, 유치 또는 축삭 1,3,4에 적합한 수용체와 공동 수용체와의 상호 작용에 따라 축삭을 물리 칠 수 있습니다. 활성화 된 수용체는 축삭 성장 콘의 움직임에 대한 골격 조직에 영향을 미치는 성장 콘에 신호를 전송합니다.
다양한 방법이 유인 및 반발 성 분자의 작용을 평가하기 위해 개발되어왔다. 화학 – 유인 및 방충제는 그라데이션 농도 성장 / 문화 매체에 투여 될 수있다 (예., 던의 챔버 또는 μ-슬라이드) 마이크로-P에 의해 고농도의 자리에 5, 6,ipette (예., 전환 분석) 7 또는 목욕 응용 프로그램 (예., 성장 원뿔 붕괴 분석) 8,9에 의해 균일 한 농도.
다른 방법은 화학 – 유인 또는 반발은 기판 10-12으로서 판 표면에 도포되어있는 스트라이프 분석 또는 마이크로 콘택트 프린팅 (μCP)를 포함한다. Thestripe 분석은 원래 병아리 레티노 – tectal 시스템 (13)의 지형 매핑을 분석하기 위해 1987 년 본회퍼와 동료에 의해 개발되었다. 원래 방법은 스트라이프와 메쉬 행렬을 사용하여 폴리 카보네이트 nucleopore 막에 코트 단백질에 진공 시스템이 필요합니다. 이상에서, 재조합 단백질을 직접적으로 좁은 슬릿 실리콘 매트릭스 (14, 15)를 사용하여, 스트라이프 패턴으로 배양 용기의 표면에 인쇄했다. 최근 여러 연구 그룹이 성공적으로 축삭지도 분자 활동 16-21의 분석이 스트라이프 분석을 적용했습니다.
<p class = "jove_content은"> 여기, 우리는 해리 해마 신경 세포에 대한 축삭지도 분자의 인력이나 반발력을 측정하는 스트라이프 분석에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다. 특히,이 방법은 최소 갖춘 실험실 설정에서 적용될 수있다. 이 분석 들어, 형광 표지 된 기판의 제어 된 단백질의 교번 스트라이프는 90 ㎛의 슬릿 실리콘 매트릭스를 이용한 플라스틱 접시에 생성되고 라미닌 코팅. 우리의 데모에서는, E15.5 마우스의 해마 신경 세포가 피브로넥틴와 류신이 풍부한 막 횡단 단백질 2 (FLRT2)과의 Fc 단백질 (21)를 제어의 재조합 ectodomain의 줄무늬 교대에 배양 하였다 해리. 배양 24 시간 후, 축삭 신경의 세포체는 모두 강하게 FLRT2 줄무늬에서 반발되었다. 항 Tau1 항체로 염색 FLRT2 반발이 강한 것을 나타내는 ~ 뉴런의 90 %가 FLRT2-FC에 ~ 10 %에 비해 된 Fc 피복 영역에 분포 된 것으로 나타났다해마의 뉴런 (21)에 대한 기능.Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 E15.5 마우스의 해마에서 재조합 단백질과 해리 신경 세포를 사용하는 스트라이프 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 스트라이프 패턴으로 배치 관심 재조합 단백질에 신경 세포의 반발 매력, 또는 중립적 인 반응을 효율적으로 관찰 할 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 이점은 특별한 행렬 진공 장치를 필요로하는 기존의 방법에 비해 단백질이 직접 플라스틱 접시의 표면에 인쇄?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Grants-in-Aid for Scientific Research from the Japan Society for the Promotion of Science (23700412, 25122707 and 26670090 to S.Y.).
Materials
| 15 mL centrifuge tube | Violamo | 1-3500-01 | |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Nacalai | 01954-85 | |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-human IgG antibody | Thermo Scientific | A11013 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-mouse IgG antibody | Thermo Scientific | A-21203 | Dilution 1/500 |
| Anti-Tau1 antibody | Chemicon | MAB3420 | Dilution 1/200 |
| Antifade | Thermo Scientific | P7481 | Alternative mounting media may be used |
| B27 supplement | Thermo Scientific | 17504-044 | Dilution 1/50 |
| Bovine serum albumin | Sigma | 01-2030-2 | |
| Cell strainer 100 um | BD Falcon | 352360 | |
| Centrifugation machine | Kubota | 2410 | |
| Cover glass 18mmx18mm | Matsunami | 18×18 mm No. 1 | |
| DAKO pen | DAKO | S2002 | Alternative water-repellent pen may be used |
| Disposable scalpel | Feather | 2975#11 | |
| FBS | Thermo Scientific | 10437-028 | |
| Fluorecent microscope | Nikon | E600 | |
| Forceps No. 5 | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| GlutaMAX | Thermo Scientific | 35050-061 | Dilution 1/200 |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 805N | 22 gauge, 50 uL |
| HBSS | Thermo Scientific | 14170-112 | |
| Human IgG, Fc Fragment | Jackson | 009-000-008 | |
| Laminin | Thermo Scientific | 23017-015 | |
| Neurobasal | Thermo Scientific | 21103-049 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson | 017-000-121 | |
| PBS | Nacalai | 14249-24 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15070-063 | Dilution 1/100 |
| Plastic culture dish, 60 mm | Thermo Scientific | 150288 | |
| Silicone Matrices | Available and purchasable from Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu) | ||
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Tip, 1000 uL | Watson | 125-1000S | |
| Transparent sticky tape | Tesa | 57315 | Alternative sticky tape may be used |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Trypan blue, 0.4% | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Trypsin/EDTA | Thermo Scientific | 25300-054 | |
| Culture medium | Neurobasal supplemented with B27, GlutaMAX and Penicillin-Streptomycin. |
References
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