Enlèvement de<em> Drosophila</em> Muscle Tissue de Fillets larvaires pour immunofluorescence Analyse des neurones sensoriels et les cellules épidermiques
Summary
Des études de la morphogenèse neuronale utilisant la drosophile arborisation dendritique larvaire (da) neurones bénéficient de la visualisation in situ des protéines neuronales et épidermiques par immunofluorescence. Nous décrivons un procédé qui permet d'améliorer l'analyse par immunofluorescence des neurones DA et des cellules épidermiques entourant en retirant le tissu musculaire de la paroi du corps de la larve.
Abstract
Larvaires arborisation dendritique (da) neurones de drosophile sont un modèle populaire pour les mécanismes de la morphogenèse neuronale enquête. Neurones Da se développent dans la communication avec les cellules de l' épiderme , ils innervent et donc leurs avantages de l' analyse de la visualisation in situ des deux protéines neuronal et épidermique exprimées par immunofluorescence. Les méthodes traditionnelles de préparation des filets larvaires pour les expériences d'immunofluorescence laissent intact le tissu musculaire qui couvre la majeure partie de la paroi du corps, présentant plusieurs défis à l'imagerie des protéines neuronales et épidermiques. Nous décrivons ici un procédé pour éliminer le tissu musculaire à partir des filets de Drosophila larves. Ce protocole permet l'imagerie des protéines qui sont autrement occulté par le tissu musculaire, améliore le rapport signal à bruit, et facilite l'utilisation de nanoscope pour étudier da développement des neurones.
Introduction
Larvaires arborisation dendritique (da) neurones de drosophile fournissent un excellent modèle pour l' étude du développement neuronal en raison de leur susceptibilité à la manipulation génétique et la facilité avec laquelle ils peuvent être visualisés. Ces neurones sensoriels ont joué un rôle dans l'identification de nombreuses voies qui contrôlent dendrites morphogenèse 1-3.
Quatre classes de neurones DA (classe I – IV) innervent l'épiderme larvaire. Ces neurones se trouvent entre la membrane basale et l'épiderme, avec leurs dendrites formant matrices bidimensionnelles en grande partie à 4,5. Sur les quatre classes, la classe IV neurones DA ont les tonnelles plus fortement ramifiée et, comme les neurones sensoriels d'autres animaux, l'élaboration de ces tonnelles exige des facteurs intrinsèques, ainsi que des indices de tissus voisins, en particulier l'épiderme, pour leur développement 6-9 .
Les études pour déterminer la façon dont ces neurones et fait extra-neuronalSOR avantage de contrôler la morphogenèse dendritique de la capacité à détecter l' expression de la protéine in situ par immunofluorescence. La cuticule externe de la larve est impénétrable aux anticorps, mais cet obstacle est facilement surmontée par la préparation des filets larvaires grâce à des méthodes de dissection bien établies 10,11. Cependant, le tissu musculaire de la paroi du corps qui se trouve juste à l'intérieur de la membrane de sous-sol présente de nombreux défis à la visualisation des neurones DA et des cellules de l'épiderme. D'abord, le tissu musculaire, qui tapisse la plupart de la paroi du corps, obscurcit considérablement des signaux fluorescents provenant d'un tissu neuronal ou épidermique. Ceci réduit considérablement le rapport signal sur bruit dans l'échantillon. D'autre part, de nombreuses protéines pertinentes peuvent être exprimées dans le tissu musculaire, ainsi que dans les neurones ou de l'épiderme. Ce signal de fluorescence dérivées du muscle est susceptible d'obscurcir davantage la détection d'un signal de fluorescence provenant du neurone ou de l'épiderme. Enfin, les progrès dans les technologies de microscopie pasl' imagerie d' un permis poids d'échantillons à une résolution de sous-diffraction et peut être particulièrement utile pour discerner la localisation de protéines qui sont exprimées dans les neurones et les cellules épidermiques entourant 12,13. Cependant, l'imagerie par microscopie de super-résolution bénéficie d'un signal fort par rapport au bruit et à proximité de l'échantillon à la lamelle. En plus de réduire le rapport signal à bruit, les larves de la paroi du corps muscle distances neurones DA de la lamelle couvre-objet, ce qui limite la résolution de l'image améliorée qui peut être obtenue avec des procédés de microscopie de super-résolution. En plus de difficultés pour l'analyse d'immunofluorescence, le tissu musculaire présente une barrière à l'enregistrement électrophysiologique des neurones sensoriels dans la paroi du corps de la larve. Son retrait profite donc la manipulation neurophysiologique des neurones sensoriels 14.
Voici une méthode pour l' extraction manuelle du Drosophila tissu musculaire larvaire est décrite. Nous démontrons que notre protocole permites immunofluorescence imagerie des protéines qui sont autrement obscurcie par le tissu musculaire, améliore le rapport signal sur bruit pour la visualisation de la classe IV neurones DA, et permet l'utilisation de super-résolution microscopique afin de mieux discriminer les relations spatiales des protéines et des structures cellulaires en neurones DA et l'épiderme.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici , un protocole est décrit pour le retrait manuel du tissu musculaire à partir des filets de Drosophila larves. Ce protocole modifie précédemment décrit les techniques de dissection larvaires 10,11. Après la larve est disséquée dans un plat en élastomère de silicone, la ligne médiane dorsale est située. Une pince à broche unique, dans son orientation la plus plane possible, est soigneusement inséré entre le tissu musculaire et l'épiderme, à proximité de la ligne médiane dors…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Gary Laïevski pour des discussions utiles sur la microscopie. Ce travail a été financé par le NIH accorde R01GM061107 et R01GM067758 à ERG
Materials
| Dumont #5 tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | |
| Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips | World Precision Instruments | 14003 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | 3097358-1004 | for dissecting plates |
| Austerlitz insect pins, 0.1 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Fostec 8375 light source | Artisan Technology Group | 62792-4 | |
| Zeiss Stemi 2000 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | for confocal microscopy |
| Prolong Diamond antifade mountant | Life Technologies | P36970 | for structured illumination microscopy |
| Micro cover glass, 22×22 mm, No. 1.5 | VWR | 48366-227 | |
| Superfrost Plus microscope slides, 25 x 75 x 1.0 mm | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Mouse anti-Coracle antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | C615.16 | supernatant, dilute 1:50 |
| Mouse anti-Discs large antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | supernatant, dilute 1:50 |
| Rabbit anti-dsRed antibody | Clontech | 632496 | dilute 1:1000 |
| Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor 568 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11011 | dilute 1:1000 |
| Goat anti-mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11001 | dilute 1:500 |
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