Kaldırılması<em> Drosophila</emDuyu Nöronlar ve Epidermal Hücre İmmünofloresan Analizi Larvaların Fileto dan> Kas Dokusu
Summary
Drosophila larva dendritik arborization (da) nöronları kullanarak nöronal morfolojilerinden Çalışmaları Immünofloresan nöronal ve epidermal proteinlerin in situ görselleştirme yarar. Larva vücut duvarı kas dokusu kaldırarak da nöronlar ve çevresindeki epidermal hücrelerin immünoflüoresans analizi artıran bir prosedür açıklanmaktadır.
Abstract
Drosophila larva dendritik arborization (da) nöronların nöronal morfolojilerinden mekanizmaları araştırmak için popüler bir modeldir. Da nöronlar böylece epidermal inerve ettikleri hücreleri ve immünofloresan hem nöronal ve epidermally ifade edilen proteinlerin in situ görselleştirme kendi analiz yararları ile iletişim gelişir. immünofloresan deneyleri için larva filetosu hazırlamak geleneksel yöntemler nöronal ve epidermal proteinleri görüntüleme için çeşitli zorluklar sunarak, vücut duvarının en kapsar kas dokusu bozulmamış bırakın. Burada Drosophila larva filetosu gelen kas dokusunu çıkarmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, aksi takdirde kas dokusu tarafından gizlenmiş olan proteinlerin görüntüleme sağlayan sinyal gürültü oranını artırır ve da nöron gelişimini incelemek için süper çözünürlük mikroskobu kullanımını kolaylaştırır.
Introduction
Drosophila larvalarının dendritik arborization (DA) nöronları dolayı genetik manipülasyona amenability ve görüntülenebilir kolaylığına nöronal gelişim çalışmak için değerli bir model sunmaktadır. Bu duyusal nöronlar dendrit morfolojilerinden 1-3 kontrol sayısız yolların belirlenmesinde etkili olmuştur.
da nöronların dört sınıfları (sınıf I – IV) larva epidermis innerve. Bu nöronlar kendi dendritler büyük ölçüde iki boyutlu diziler 4,5 oluşturan, bazal membran ve epidermis arasında yalan. Dört sınıfların, sınıf IV da nöronların diğer hayvanların duyusal nöronlar gibi en çok dallı milleri ve sahip, bu milleri detaylandırılması onların gelişiminde 6-9 komşu dokulardan içsel faktörlerin yanı sıra kuyruklar, özellikle epidermis gerektirir .
Çalışmalar nasıl böyle nöronal ve ekstra nöronal gerçeği belirlemek içinors Immünofloresan in situ protein ifade algılamak için yeteneği dendrit morfolojilerinden fayda kontrol eder. Larva dış kütikül antikorlara aşılmaz, ama bu engel kolayca köklü diseksiyon yöntemlerinin 10,11 ile larva filetosu hazırlanması ile aşılır. Ancak, bazal membran sadece iç yatıyor vücut duvarı kas dokusu da nöron ve epidermal hücrelerin görselleştirme yönelik çeşitli zorluklar getirmektedir. İlk olarak, kas dokusu, vücut duvarının en çizgileri, büyük ölçüde nöronal veya epidermal dokudan kaynaklanan floresan sinyalleri örttüğü. Bu esas olarak örnek sinyal gürültü oranını azaltır. İkinci olarak, çok sayıda alakalı proteinler kas dokusu, hem de nöronlar veya epidermis eksprese edilebilir. Bu, kas kaynaklı floresans sinyali nöron veya epidermis bir floresans sinyalinin daha belirsiz algılama muhtemeldir. Son olarak, mikroskopi teknolojilerinde gelişmeleralt difraksiyon çözünürlükte numune B izin görüntüleme ve epidermal hücrelerin 12,13 nöronlarda ifade edilen proteinleri lokalizasyonu ayırt ve çevresindeki özellikle yararlı olabilir. Ancak gürültü oranı ve lamel numune yakın güçlü bir sinyal süper çözünürlük mikroskopi faydaları aracılığıyla görüntüleme. sinyal gürültü oranını azaltmak için ek olarak, larva vücut duvarı kas mesafeleri böylece süper çözünürlük mikroskobu yöntemlerle elde edilebilir, geliştirilmiş görüntü çözünürlüğü sınırlayıcı lamel gelen da nöronlar. immünofloresan analizi için zorluklar yanında, kas dokusu larva vücut duvarı duyusal nöronlardan elektrofizyolojik kayıt için bir engel sunar. Onun kaldırma bu nedenle duyu nöronlarının 14 nörofizyolojik manipülasyon yararlanır.
Burada Drosophila larvalarının kas dokusunun elle çıkarılması için bir yönteme ilişkindir açıklanmaktadır. Bizim protokol p göstermektediraksi kas dokusu tarafından bulanıklaştırılmaktadır proteinlerin ermits immünofloresan görüntüleme, sınıf IV da nöronlar görselleştirilmesi için sinyal gürültü oranını iyileştirir ve daha da nöronlarda protein ve hücresel yapıların mekansal ilişkileri ayırmak için süper çözünürlük mikroskobu kullanılmasını sağlar ve epidermis.
Protocol
Representative Results
Discussion
İşte bir protokol Drosophila larva filetosu kas dokusunun elle çıkarılması için açıklanmıştır. Bu protokol daha önce larva diseksiyon teknikleri 10,11 tarif değiştirir. Larva bir silikon elastomer çanak disseke sonra, dorsal orta hat yer almaktadır. Tek bir forseps uçlu olarak, en düz mümkün olan yönde, dikkatli bir şekilde dorsal orta hattın yakınlarındaki, kas dokusu ve epidermis arasına yerleştirilir. forseps yavaşça ilgi her larva segmentinde bir çapa noktasından a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz mikroskobu üzerinde yararlı tartışmalar için Gary Laevsky teşekkür ederiz. NIH tarafından finanse edildi Bu çalışma ERG R01GM061107 ve R01GM067758 verir
Materials
| Dumont #5 tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | |
| Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips | World Precision Instruments | 14003 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | 3097358-1004 | for dissecting plates |
| Austerlitz insect pins, 0.1 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Fostec 8375 light source | Artisan Technology Group | 62792-4 | |
| Zeiss Stemi 2000 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | for confocal microscopy |
| Prolong Diamond antifade mountant | Life Technologies | P36970 | for structured illumination microscopy |
| Micro cover glass, 22×22 mm, No. 1.5 | VWR | 48366-227 | |
| Superfrost Plus microscope slides, 25 x 75 x 1.0 mm | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Mouse anti-Coracle antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | C615.16 | supernatant, dilute 1:50 |
| Mouse anti-Discs large antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | supernatant, dilute 1:50 |
| Rabbit anti-dsRed antibody | Clontech | 632496 | dilute 1:1000 |
| Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor 568 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11011 | dilute 1:1000 |
| Goat anti-mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11001 | dilute 1:500 |
References
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, M. D., Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields. Annu Rev Neurosci. 30, 399-423 (2007).
- Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in Drosophila sensory neurons. Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).
- Han, C., et al. Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of Drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space. Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).
- Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in Drosophila sensory neurons. Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).
- Jiang, N., Soba, P., Parker, E., Kim, C. C., Parrish, J. Z. The microRNA bantam regulates a developmental transition in epithelial cells that restricts sensory dendrite growth. Development. 141 (13), 2657-2668 (2014).
- Meltzer, S., et al. Epidermis-derived Semaphorin promotes dendrite self-avoidance by regulating dendrite-substrate adhesion in Drosophila sensory neurons. Neuron. 89 (4), 741-755 (2016).
- Han, C., et al. Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila. Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. (24), (2009).
- Karim, M. R., Moore, A. W. Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics. J Vis Exp. (57), e3111 (2011).
- Gustafsson, J. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. Molecular flow quantified beyond the diffraction limit by spatiotemporal image correlation of structured illumination microscopy data. Biophys J. 107 (9), L21-L23 (2014).
- Zhang, W., Yan, Z., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Sound response mediated by the TRP channels NOMPC, NANCHUNG, and INACTIVE in chordotonal organs of Drosophila larvae. PNAS. 10 (33), 13612-13617 (2013).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).
