Rimozione di<em> Drosophila</em> Tessuto muscolare da larvali Filetti per l'analisi di immunofluorescenza dei neuroni sensoriali e cellule epidermiche
Summary
Studi di morfogenesi neuronale utilizzando Drosophila larvale arborizzazione dendritiche (bis) i neuroni beneficiano di visualizzazione situ delle proteine neuronali e epidermiche mediante immunofluorescenza. Descriviamo una procedura che migliora l'analisi di immunofluorescenza di DA neuroni e cellule epidermiche circostanti, rimuovendo il tessuto muscolare dalla parete del corpo larvale.
Abstract
Larvali arborizzazione dendritica (DA) neuroni Drosophila sono un modello popolare per lo studio dei meccanismi di morfogenesi neuronale. Da neuroni sviluppano in comunicazione con le cellule epidermiche che innervano e quindi le loro prestazioni di analisi da in situ visualizzazione di entrambe le proteine neuronally e epidermally espresse mediante immunofluorescenza. I metodi tradizionali di preparazione di filetti larvale per esperimenti di immunofluorescenza lasciano intatto il tessuto muscolare che copre la maggior parte della parete del corpo, che presenta diverse sfide per l'imaging neuronale e epidermiche proteine. Qui si descrive un metodo per la rimozione di tessuto muscolare dalla Drosophila filetti larvale. Questo protocollo permette l'imaging di proteine che sono altrimenti oscurata da tessuto muscolare, migliora il rapporto segnale rumore, e facilita l'utilizzo della microscopia super-risoluzione per studiare da sviluppo neurone.
Introduction
Larvali arborizzazione dendritica (DA) neuroni Drosophila forniscono un modello valido per lo studio dello sviluppo neuronale a causa della loro riconducibilità alla manipolazione genetica e la facilità con cui possono essere esposte. Questi neuroni sensoriali sono state fondamentali per l'identificazione di numerosi sentieri che controllano dendrite morfogenesi 1-3.
Quattro classi di Da neuroni (classe I – IV) innervare l'epidermide larvali. Questi neuroni si trovano tra la membrana basale e l'epidermide, con i loro dendriti formazione di matrici sostanzialmente bidimensionali 4,5. Dei quattro classi, la classe IV DA neuroni hanno le pergole più altamente ramificata e, come i neuroni sensoriali di altri animali, l'elaborazione di questi pergole richiede fattori intrinseci come pure spunti da tessuti vicini, in particolare l'epidermide, per il loro sviluppo 6-9 .
Gli studi per determinare come tale neuronale e infatti extra-neuronaleors controllare beneficio morfogenesi dei dendriti dalla capacità di rilevare l'espressione della proteina in situ mediante immunofluorescenza. La cuticola esterno della larva è impenetrabile agli anticorpi, ma questo impedimento è facilmente superabile dalla preparazione di filetti larvale attraverso metodi dissezione consolidati 10,11. Tuttavia, il tessuto muscolare parete del corpo che si trova appena interno alla membrana basale presenta varie sfide verso visualizzazione DA neuroni e cellule epidermiche. Innanzitutto, il tessuto muscolare, quali linee maggior parte della parete del corpo, oscura notevolmente segnali fluorescenti provenienti da tessuto neuronale o epidermico. Questo riduce notevolmente il rapporto segnale-rumore nel campione. Secondo, molte proteine rilevanti possono essere espressi nel tessuto muscolare e nei neuroni o dell'epidermide. Questo segnale di fluorescenza muscolare derivato probabilmente ancora rilevamento oscura di un segnale di fluorescenza dal neurone o epidermide. Infine, i progressi nelle tecnologie di microscopia nol'imaging permesso w di campioni con risoluzione sub-diffrazione e può essere particolarmente utile nel discernere la localizzazione delle proteine che vengono espresse in neuroni e cellule epidermiche circostanti 12,13. Tuttavia, l'imaging via super-risoluzione benefici microscopia da un forte rapporto segnale-rumore e la vicinanza del campione al vetrino. Oltre a ridurre il rapporto segnale rumore, la parete del corpo larvali distanze muscolari DA neuroni dal vetrino, limitando così la risoluzione dell'immagine migliorata che può essere ottenuto con metodi di microscopia super-risoluzione. Oltre le sfide per l'analisi di immunofluorescenza, tessuto muscolare presenta una barriera alla registrazione elettrofisiologica da neuroni sensoriali nella parete del corpo larvale. La sua rimozione beneficia pertanto manipolazione neurofisiologica dei neuroni sensoriali 14.
Qui un metodo per la rimozione manuale di Drosophila tessuto muscolare larvale è descritto. Abbiamo dimostrato che il nostro protocollo permits immagini immunofluorescenza di proteine che sono altrimenti oscurata da tessuto muscolare, migliora il rapporto segnale-rumore per la visualizzazione di classe IV DA neuroni, e consente l'utilizzo della microscopia super-risoluzione per discriminare meglio relazioni spaziali di proteine e strutture cellulari in DA neuroni e l'epidermide.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui un protocollo è descritto per la rimozione manuale del tessuto muscolare da Drosophila filetti larvale. Questo protocollo modifica precedentemente descritto tecniche di dissezione larvali 10,11. Dopo la larva è sezionato in un piatto elastomero siliconico, la linea mediana dorsale si trova. Una singola pinza polo, nella sua più piatto possibile orientamento, è attentamente inserito tra il tessuto muscolare e l'epidermide, vicino alla linea mediana dorsale. Le pinze sono delicatamente tira…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Gary Laevsky per le discussioni utili su microscopia. Questo lavoro è stato finanziato dal NIH concede R01GM061107 e R01GM067758 di ERG
Materials
| Dumont #5 tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | |
| Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips | World Precision Instruments | 14003 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | 3097358-1004 | for dissecting plates |
| Austerlitz insect pins, 0.1 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Fostec 8375 light source | Artisan Technology Group | 62792-4 | |
| Zeiss Stemi 2000 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | for confocal microscopy |
| Prolong Diamond antifade mountant | Life Technologies | P36970 | for structured illumination microscopy |
| Micro cover glass, 22×22 mm, No. 1.5 | VWR | 48366-227 | |
| Superfrost Plus microscope slides, 25 x 75 x 1.0 mm | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Mouse anti-Coracle antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | C615.16 | supernatant, dilute 1:50 |
| Mouse anti-Discs large antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | supernatant, dilute 1:50 |
| Rabbit anti-dsRed antibody | Clontech | 632496 | dilute 1:1000 |
| Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor 568 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11011 | dilute 1:1000 |
| Goat anti-mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11001 | dilute 1:500 |
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