Удаление<em> Drosophila</em> Мышечной ткани из личиночной филе для иммунофлуоресценции анализа сенсорных нейронах и эпидермальных клеток
Summary
Исследования нейронов формообразования с использованием дрозофилы личиночной разветвление дендритов (DA) нейроны выгоду от визуализации на месте нейрональных и эпидермальных белков в иммунофлюоресценции. Мы опишем процедуру, которая улучшает иммунофлуоресцентного анализ нейронов да и окружающих клеток эпидермиса путем удаления мышечной ткани от личиночной стенки тела.
Abstract
Дрозофилы личиночной дендритных разветвление (да) нейроны являются популярной моделью для исследования механизмов морфогенеза нейронов. Da нейроны развиваются в связи с эпидермальных клеток , которые они возбуждают и , следовательно , их анализ выгод от in – situ визуализации обоих neuronally и epidermally выраженных белков с помощью иммунофлюоресценции. Традиционные способы приготовления личиночной филе для иммунофлюоресценции экспериментов оставить нетронутыми мышечной ткани, которая покрывает большую часть стенки тела, представляя несколько проблем для визуализации нейронов и эпидермальные белки. Здесь мы опишем метод удаления мышечной ткани от дрозофилы личиночной филе. Этот протокол позволяет визуализации белков, которые в противном случае затемняется мышечной ткани, улучшает отношение сигнал-шум и облегчает использование сверхвысокого разрешения микроскопии для изучения развития да нейрон.
Introduction
Дрозофилы личиночной дендритных разветвление (да) нейроны обеспечивают ценную модель для изучения развития нейронов из – за их аменабельности генетической манипуляции и легкость , с которой они могут быть изображаемого. Эти сенсорные нейроны играют важную роль в выявлении многочисленных путей , которые контролируют дендритов морфогенеза 1-3.
Четыре класса нейронов да (класс I – IV) иннервируют личиночной эпидермис. Эти нейроны лежат между базальной мембраной и эпидермиса, с их дендриты образуя в основном двумерные массивы 4,5. Из четырех классов, класс IV – да нейроны имеют наиболее сильно разветвленные беседок и, как сенсорные нейроны других животных, разработка этих беседок требует внутренних факторов, а также сигналы от соседних тканей, в частности , эпидермис, для их развития 6-9 ,
Исследования с целью определения того, как такое нейронные и экстра-нейронную фактПРС управления дендритов преимущество морфогенез от способности обнаружить экспрессию белка на месте с помощью иммунофлуоресценции. Наружная кожица личинки непроницаема для антител, но это препятствие легко преодолевается подготовки личиночной филе с помощью хорошо известных методов рассечение 10,11. Тем не менее, стенки тела мышечной ткани, которая лежит только интерьер к базальной мембране представляет несколько проблем по отношению к визуализации нейронов да и эпидермальных клеток. Во-первых, мышечной ткани, что линии большинство стенки тела, сильно затемняет флуоресцентные сигналы, исходящие от нервных клеток или эпидермальной ткани. Это в значительной степени уменьшает отношение сигнала к шуму в образце. Во-вторых, многие соответствующие белки могут быть выражены в мышечной ткани, а также в нейронах или эпидермиса. Эта мышца полученный сигнал флуоресценции, вероятно, еще неясного обнаружения сигнала флуоресценции от нейроном или эпидермиса. И, наконец, достижения в области микроскопии технологий нетж разрешение изображения образцов при разрешении суб-дифракционного и может быть особенно полезно в плане определения локализации белков, которые экспрессируются в нейронах и окружающих клеток эпидермиса 12,13. Тем не менее, визуализация с помощью супер-разрешения преимуществ микроскопии от сильного сигнала к шуму и непосредственной близости от образца к покровным. В дополнение к уменьшению сигнала к шуму, личиночные стенки тела мышечные расстояния да нейронов от покровного, ограничивая тем самым улучшенное разрешение изображения, которое может быть достигнуто с помощью методов микроскопии сверхвысокого разрешения. Кроме проблем для иммунофлуоресцентного анализа, мышечной ткани представляет собой барьер для электрофизиологические записи от сенсорных нейронов в личиночной стенки тела. Поэтому его удаление преимущества нейрофизиологическую манипуляции сенсорных нейронов 14.
Вот способ ручного удаления дрозофилы личиночной мышечной ткани описана. Показано, что наш протокол рermits иммунофлюоресценции визуализации белков, которые в противном случае затемняется мышечной ткани, улучшает соотношение сигнал-шум для визуализации IV класса нейронов да, и дает возможность использовать сверхвысокого разрешения микроскопии, чтобы лучше различать пространственные соотношения белков и клеточных структур в нейронов да и эпидермис.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь протокол описан для ручного удаления мышечной ткани от дрозофилы личиночной филе. Этот протокол модифицирует ранее описанных методов личиночной рассечение 10,11. После того, как личинка рассекают в силиконового эластомера блюдо, средней линии спины расположен. Один пин…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Гари Лаевский за полезные дискуссии по микроскопии. Эта работа финансировалась NIH предоставляет R01GM061107 и R01GM067758 с ERG
Materials
| Dumont #5 tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | |
| Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips | World Precision Instruments | 14003 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | 3097358-1004 | for dissecting plates |
| Austerlitz insect pins, 0.1 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Fostec 8375 light source | Artisan Technology Group | 62792-4 | |
| Zeiss Stemi 2000 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | for confocal microscopy |
| Prolong Diamond antifade mountant | Life Technologies | P36970 | for structured illumination microscopy |
| Micro cover glass, 22×22 mm, No. 1.5 | VWR | 48366-227 | |
| Superfrost Plus microscope slides, 25 x 75 x 1.0 mm | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Mouse anti-Coracle antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | C615.16 | supernatant, dilute 1:50 |
| Mouse anti-Discs large antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | supernatant, dilute 1:50 |
| Rabbit anti-dsRed antibody | Clontech | 632496 | dilute 1:1000 |
| Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor 568 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11011 | dilute 1:1000 |
| Goat anti-mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11001 | dilute 1:500 |
References
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, M. D., Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields. Annu Rev Neurosci. 30, 399-423 (2007).
- Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in Drosophila sensory neurons. Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).
- Han, C., et al. Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of Drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space. Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).
- Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in Drosophila sensory neurons. Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).
- Jiang, N., Soba, P., Parker, E., Kim, C. C., Parrish, J. Z. The microRNA bantam regulates a developmental transition in epithelial cells that restricts sensory dendrite growth. Development. 141 (13), 2657-2668 (2014).
- Meltzer, S., et al. Epidermis-derived Semaphorin promotes dendrite self-avoidance by regulating dendrite-substrate adhesion in Drosophila sensory neurons. Neuron. 89 (4), 741-755 (2016).
- Han, C., et al. Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila. Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. (24), (2009).
- Karim, M. R., Moore, A. W. Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics. J Vis Exp. (57), e3111 (2011).
- Gustafsson, J. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. Molecular flow quantified beyond the diffraction limit by spatiotemporal image correlation of structured illumination microscopy data. Biophys J. 107 (9), L21-L23 (2014).
- Zhang, W., Yan, Z., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Sound response mediated by the TRP channels NOMPC, NANCHUNG, and INACTIVE in chordotonal organs of Drosophila larvae. PNAS. 10 (33), 13612-13617 (2013).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).
