Verwijdering van<em> Drosophila</em> Spier Weefsel van Larvale Filets voor Immunofluorescentie Analyse van sensorische neuronen en opperhuidcellen
Summary
Studies van neuronale morfogenese met behulp van Drosophila larvale dendritische arborization (bis) neuronen profiteren van in situ visualisatie van neuronale en epidermale eiwitten door immunofluorescentie. We beschrijven een werkwijze die immunofluorescentie analyse van da neuronen en omliggende epidermale cellen verbetert door het verwijderen spierweefsel van de larvale lichaamswand.
Abstract
Drosophila larvale dendritische arborization (bis) neuronen zijn een populair model voor het onderzoek naar de mechanismen van neuronale morfogenese. Da neuronen ontwikkelen in verbinding met de epidermale cellen ze innerveren en dus hun analyse geniet in situ visualisatie van zowel neuronaal en epidermaal expressie gebrachte proteïnen door immunofluorescentie. Traditionele werkwijzen voor het bereiden larvale filets immunofluorescentie experimenten intact spierweefsel dat de meeste lichaamswand bedekt, presenteert verscheidene uitdagingen voor neuronale en epidermale eiwitten beeldvorming. Hier beschrijven we een werkwijze voor het verwijderen spierweefsel van Drosophila larven filets. Dit protocol maakt beeldvorming van eiwitten die anderszins verduisterd door spierweefsel, verbetert de signaal-ruisverhouding, en vergemakkelijkt het gebruik van superresolutietechnieken da neuron ontwikkeling bestuderen.
Introduction
Drosophila larven dendritische arborization (bis) neuronen een waardevol model voor het bestuderen van neuronale ontwikkeling door hun ontvankelijkheid voor genetische manipulatie en het gemak waarmee ze kunnen worden afgebeeld. Deze sensorische neuronen zijn instrumenteel in de identificatie van een groot aantal trajecten die dendriet morfogenese 1-3 controle geweest.
Vier klassen van da neuronen (klasse I – IV) innerveren het larvale epidermis. Deze neuronen liggen tussen het basale membraan en de epidermis, met hun dendrieten vormen voornamelijk tweedimensionale arrays 4,5. Van de vier klassen, klasse IV da neuronen hebben de meest sterk vertakte priëlen en, net als sensorische neuronen van andere dieren, de uitwerking van deze cilinders vereist intrinsieke factoren evenals signalen uit het naburige weefsels, met name de epidermis, voor hun ontwikkeling 6-9 .
Studies om te bepalen hoe dergelijke neuronale en extra-neuronale feitors controle dendriet morfogenese profiteren van de mogelijkheid om eiwitexpressie te detecteren in situ door immunofluorescentie. De buitenste cuticula van de larve is ondoordringbaar voor antilichamen, maar deze belemmering wordt gemakkelijk overwonnen door het opstellen van larvale filets door middel van goed gevestigde dissectie methoden 10,11. Echter, het lichaam muur spieren die net interieur ligt aan het basaal membraan presenteert een aantal uitdagingen voor visualisatie van da neuronen en epidermale cellen. Ten eerste, het spierweefsel, welke lijnen meeste lichaamswand, verduistert sterk fluorescente signalen van neuronaal of epidermaal weefsel. Dit vermindert aanzienlijk de signaal-ruisverhouding in het monster. Ten tweede kan veel relevante eiwitten tot expressie worden gebracht in het spierweefsel en in de neuronen of epidermis. Deze spier afgeleide fluorescentiesignaal waarschijnlijk verder obscure detectie van een fluorescentiesignaal van het neuron of epidermis. Tot slot, de vooruitgang in de microscopie technologieën geenw vergunning beeldvorming van monsters bij sub-diffractie resolutie en kan in het bijzonder nuttig zijn bij het onderscheiden van de lokalisatie van eiwitten die worden uitgedrukt in neuronen en omliggende opperhuidcellen 12,13 zijn. Echter, imaging via super-resolutie microscopie profiteert van een sterk signaal-ruisverhouding en de nabijheid van het monster op het dekglaasje. Naast het verminderen van de signaal-ruisverhouding, de larvale lichaamswand spier afstanden da neuronen van het dekglaasje, waardoor de verbeterde beeldresolutie die kan worden bereikt met superresolutietechnieken werkwijzen beperken. Naast de uitdagingen voor immunofluorescentie analyse, spierweefsel presenteert een belemmering voor elektrofysiologische opname van sensorische neuronen in het larvale lichaam muur. De verwijdering ervan profiteert daarom neurofysiologische manipulatie van sensorische neuronen 14.
Hier een werkwijze voor handmatig verwijderen van Drosophila larven spierweefsel wordt beschreven. We tonen aan dat ons protocol permits immunofluorescentie beeldvorming van eiwitten die anderszins verduisterd door spierweefsel, verbetert de signaal-ruisverhouding voor visualisatie van klasse IV da neuronen, en maakt het gebruik van superresolutietechnieken beter onderscheid ruimtelijke relaties van eiwitten en cellulaire structuren da neuronen en de epidermis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier wordt een protocol beschreven voor het handmatig verwijderen van spierweefsel van Drosophila larvale filets. Dit protocol modificeert eerder beschreven larvale dissectie technieken 10,11. Nadat de larve wordt ontleed in een siliconenelastomeer schaal wordt de dorsale middellijn bevindt. Een enkele tang tand in zijn vlakste mogelijke oriëntatie, wordt zorgvuldig ingevoegd tussen het spierweefsel en de opperhuid, in de buurt van de dorsale middellijn. De tang worden voorzichtig getrokken naar bov…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Gary Laevsky voor nuttige discussies over microscopie. Dit werk werd gefinancierd door de NIH subsidies R01GM061107 en R01GM067758 te ERG
Materials
| Dumont #5 tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | |
| Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips | World Precision Instruments | 14003 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | 3097358-1004 | for dissecting plates |
| Austerlitz insect pins, 0.1 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Fostec 8375 light source | Artisan Technology Group | 62792-4 | |
| Zeiss Stemi 2000 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | for confocal microscopy |
| Prolong Diamond antifade mountant | Life Technologies | P36970 | for structured illumination microscopy |
| Micro cover glass, 22×22 mm, No. 1.5 | VWR | 48366-227 | |
| Superfrost Plus microscope slides, 25 x 75 x 1.0 mm | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Mouse anti-Coracle antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | C615.16 | supernatant, dilute 1:50 |
| Mouse anti-Discs large antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | supernatant, dilute 1:50 |
| Rabbit anti-dsRed antibody | Clontech | 632496 | dilute 1:1000 |
| Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor 568 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11011 | dilute 1:1000 |
| Goat anti-mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11001 | dilute 1:500 |
References
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, M. D., Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields. Annu Rev Neurosci. 30, 399-423 (2007).
- Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in Drosophila sensory neurons. Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).
- Han, C., et al. Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of Drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space. Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).
- Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in Drosophila sensory neurons. Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).
- Jiang, N., Soba, P., Parker, E., Kim, C. C., Parrish, J. Z. The microRNA bantam regulates a developmental transition in epithelial cells that restricts sensory dendrite growth. Development. 141 (13), 2657-2668 (2014).
- Meltzer, S., et al. Epidermis-derived Semaphorin promotes dendrite self-avoidance by regulating dendrite-substrate adhesion in Drosophila sensory neurons. Neuron. 89 (4), 741-755 (2016).
- Han, C., et al. Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila. Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. (24), (2009).
- Karim, M. R., Moore, A. W. Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics. J Vis Exp. (57), e3111 (2011).
- Gustafsson, J. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. Molecular flow quantified beyond the diffraction limit by spatiotemporal image correlation of structured illumination microscopy data. Biophys J. 107 (9), L21-L23 (2014).
- Zhang, W., Yan, Z., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Sound response mediated by the TRP channels NOMPC, NANCHUNG, and INACTIVE in chordotonal organs of Drosophila larvae. PNAS. 10 (33), 13612-13617 (2013).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).
