Eliminación de<em> Drosophila</em> Tejido muscular de larvas Filetes para el análisis de inmunofluorescencia de las neuronas sensoriales y las células epidérmicas
Summary
Los estudios de la morfogénesis neuronal utilizando Drosophila arborización dendrítica larval (DA) se benefician de las neuronas en la visualización in situ de las proteínas neuronales y epidérmicas por inmunofluorescencia. Se describe un procedimiento que mejora el análisis de inmunofluorescencia de DA neuronas y las células epidérmicas que rodean mediante la eliminación de tejido muscular de la pared del cuerpo de la larva.
Abstract
Arborización dendrítica (DA), las neuronas de larvas de Drosophila son un modelo popular para la investigación de los mecanismos de morfogénesis neuronal. Da neuronas desarrollan en comunicación con las células epidérmicas que inervan y por tanto su análisis de beneficios de la visualización in situ de las dos proteínas expresadas neuronalmente y epidérmicamente por inmunofluorescencia. Los métodos tradicionales de preparación de filetes de larvas para experimentos de inmunofluorescencia dejan intacto el tejido muscular que cubre la mayor parte de la pared del cuerpo, que presenta varios desafíos para la formación de imágenes proteínas neuronales y epidérmicas. Aquí se describe un método para eliminar el tejido muscular de Drosophila filetes de larvas. Este protocolo permite que las imágenes de las proteínas que se oscurece de otra manera por el tejido muscular, mejora la relación señal a ruido, y facilita el uso de super-resolución microscopía para estudiar da el desarrollo de la neurona.
Introduction
Arborización dendrítica (da), las neuronas de larvas de Drosophila proporcionan un modelo valioso para el estudio del desarrollo neuronal debido a su susceptibilidad a la manipulación genética y la facilidad con la que pueden obtenerse imágenes. Estas neuronas sensoriales han sido instrumentales en la identificación de numerosas vías que controlan la morfogénesis de dendritas 1-3.
Cuatro clases de neuronas DA (clase I – IV) inervar la epidermis de las larvas. Estas neuronas se encuentran entre la membrana basal y la epidermis, con sus dendritas formando matrices en gran medida de dos dimensiones 4,5. De las cuatro clases, clase IV da neuronas tienen las glorietas más altamente ramificada y, al igual que las neuronas sensoriales de otros animales, la elaboración de estas pérgolas requiere factores intrínsecos, así como las señales de los tejidos vecinos, particularmente en la epidermis, para su desarrollo 6-9 .
Los estudios para determinar las modalidades de dicha neuronal y hecho de extra-neuronalORS controlar beneficio morfogénesis dendrita de la capacidad de detectar la expresión de proteínas in situ por inmunofluorescencia. La cutícula exterior de la larva es impenetrable a los anticuerpos, pero este impedimento es fácilmente superada por la preparación de filetes de larvas a través de métodos de disección bien establecidos 10,11. Sin embargo, el tejido muscular de la pared del cuerpo que se encuentra justo interior a la membrana basal presenta varios retos hacia la visualización de las neuronas DA y las células epidérmicas. En primer lugar, el tejido muscular, lo que la mayoría de las líneas de la pared del cuerpo, oscurece considerablemente señales fluorescentes que emanan de tejido neuronal o epidérmica. Esto reduce sustancialmente la relación señal a ruido en la muestra. En segundo lugar, muchas proteínas relevantes pueden expresarse en el tejido muscular, así como en las neuronas o epidermis. Esta señal de fluorescencia derivada de músculo es probable que aún más la detección oscura de una señal de fluorescencia de la neurona o epidermis. Por último, los avances en las tecnologías de microscopía sinw imágenes permiso de muestras a una resolución de sub-difracción y puede ser especialmente útil en el discernimiento de la localización de las proteínas que se expresan en las neuronas y células de la epidermis que rodea 12,13. Sin embargo, las imágenes a través de super-resolución de microscopía se beneficia de una fuerte relación señal a ruido y la proximidad de la muestra al cubreobjetos. Además de reducir la relación señal a ruido, la pared del cuerpo distancias musculares larvas da a las neuronas de la cubreobjetos, limitando de este modo la resolución de imagen mejorado que se puede conseguir con métodos de microscopía super-resolución. Además de retos para el análisis de inmunofluorescencia, el tejido muscular presenta una barrera para el registro electrofisiológico de las neuronas sensoriales en la pared corporal de larvas. Por tanto, su eliminación se beneficia manipulación neurofisiológica de las neuronas sensoriales 14.
Aquí se describe un método para la extracción manual de Drosophila tejido muscular larval. Se demuestra que nuestro protocolo permits de formación de imágenes de inmunofluorescencia de las proteínas que se oscurece de otra manera por el tejido muscular, mejora la relación señal a ruido para la visualización de clase IV neuronas DA, y permite el uso de super-resolución microscopía para discriminar mejor las relaciones espaciales de proteínas y estructuras celulares en Da neuronas y la epidermis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí un protocolo se describe para la extracción manual de tejido muscular de Drosophila filetes de larvas. Este protocolo descrito previamente modifica la técnica de disección de las larvas 10,11. Después de la larva se diseca en una placa de elastómero de silicona, la línea media dorsal se encuentra. Una sola pinzas de punta, en su orientación más plana posible, se inserta cuidadosamente entre el tejido muscular y la epidermis, cerca de la línea media dorsal. El fórceps se tira suavement…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Gary Laevsky útil para los debates sobre la microscopía. Este trabajo fue financiado por el NIH subvenciones R01GM061107 y R01GM067758 a ERG
Materials
| Dumont #5 tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | |
| Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips | World Precision Instruments | 14003 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | 3097358-1004 | for dissecting plates |
| Austerlitz insect pins, 0.1 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Fostec 8375 light source | Artisan Technology Group | 62792-4 | |
| Zeiss Stemi 2000 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | for confocal microscopy |
| Prolong Diamond antifade mountant | Life Technologies | P36970 | for structured illumination microscopy |
| Micro cover glass, 22×22 mm, No. 1.5 | VWR | 48366-227 | |
| Superfrost Plus microscope slides, 25 x 75 x 1.0 mm | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Mouse anti-Coracle antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | C615.16 | supernatant, dilute 1:50 |
| Mouse anti-Discs large antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | supernatant, dilute 1:50 |
| Rabbit anti-dsRed antibody | Clontech | 632496 | dilute 1:1000 |
| Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor 568 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11011 | dilute 1:1000 |
| Goat anti-mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11001 | dilute 1:500 |
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