تصوير لايف لدراسة أنيبيب عدم الاستقرار الديناميكي في سرطان الثدي المقاومة للالتاكسين
Summary
In this paper, we report a protocol describing an in vivo method to measure microtubule dynamic instability in docetaxel-resistant breast cancer cells (MCF-7TXT). In this method, a deconvolution microscopy imaging system is used to detect the expression of GFP-tubulin in target cells.
Abstract
Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane resistance in cancerous cells drastically reduces the effectiveness of the drugs’ long-term usage. Accumulated evidence suggests that the mechanisms underlying taxane resistance include both general mechanisms, such as the development of multidrug resistance due to the overexpression of drug-efflux proteins, and taxane-specific mechanisms, such as those that involve microtubule dynamics.
Because taxanes target cell microtubules, measuring microtubule dynamic instability is an important step in determining the mechanisms of taxane resistance and provides insight into how to overcome this resistance. In the experiment, an in vivo method was used to measure microtubule dynamic instability. GFP-tagged α-tubulin was expressed and incorporated into microtubules in MCF-7 cells, allowing for the recording of the microtubule dynamics by time lapse using a sensitive camera. The results showed that, as opposed to the non-resistant parental MCF-7CC cells, the microtubule dynamics of docetaxel-resistant MCF-7TXT cells are insensitive to docetaxel treatment, which causes the resistance to docetaxel-induced mitotic arrest and apoptosis. This paper will outline this in vivo method of measuring microtubule dynamic instability.
Introduction
السبب الرئيسي لوفيات سرطان الثدي هو ورم خبيث من خلال 1، 2. Taxanes، مثل DOCETAXEL وباكليتاكسيل، وتستخدم حاليا منصب نظم الخط الأول في علاج سرطان الثدي النقيلي 2، 3، 4، 5، 6. وهم جزء من مجموعة من العوامل التي تستهدف أنيبيب (الاتفاقات التجارية المتعددة الأطراف) التي تعطل ديناميات أنيبيب. ومع ذلك، واحدة من أكبر التحديات التي تواجه استخدام taxanes في العلاج العلاجية هو تطور مقاومة التاكسين في الخلايا السرطانية، الأمر الذي يؤدي إلى تكرار المرض 7. حسابات مقاومة العقاقير لأكثر من 90٪ من مجموع وفيات بين المرضى الذين يعانون من سرطان الثدي النقيلي 7.
تتشكل الأنابيب الدقيقة عن طريق بلمرة heterodimers ألفا و-β تويولينالطبقة = "XREF"> 8 و 9. تنظيم دقيق للديناميات أنيبيب مهم للعديد من الوظائف الخلوية، بما في ذلك الاستقطاب الخلايا، تقدم دورة الخلية والنقل داخل الخلايا، وإشارات الخلية. سوف ديسريغولاتيون من الأنابيب الدقيقة وديناميتها تعطيل وظائف الخلايا ويؤدي إلى موت الخلايا 10 و 11. اعتمادا على الكيفية التي تسبب هذه التقلبات، والمخدرات MTA يمكن أن تصنف على أنها إما أنيبيب استقرار وكلاء (أي taxanes) أو وكلاء أنيبيب-destabalizing (أي قلويدات فينكا أو الموقع الكولشيسين وكلاء ملزمة) 20. وعلى الرغم من آثار عكسية على كتلة أنيبيب، في جرعة كافية، يمكن أن كلتا الفئتين تقتل الخلايا السرطانية عن طريق تأثيرها على ديناميات أنيبيب 21.
Taxanes تعمل في المقام الأول عن طريق تثبيت المغزل أنيبيب 12، مما أدى إلىاختلال الكروموسومات. تفعيل دائم لاحق من حاجز الجمعية المغزل (SAC) يعتقل خلية في الانقسام. ثم يسبب اعتقال الإنقسامية لفترات طويلة موت الخلايا المبرمج 13 و 14. التاكسين تتفاعل مع الأنابيب الدقيقة من خلال موقع التاكسين ملزم على β تويولين 8 و 15، التي هي موجودة فقط في تويولين تجميعها 16.
وقد تم اقتراح آليات متعددة للمقاومة التاكسين 9، 17. وتشمل هذه الآليات على حد سواء المقاومة للأدوية المتعددة العامة بسبب overexpression من البروتينات هروب رأس المال من المخدرات والتاكسين محددة المقاومة 5، 9، 18، 19. على سبيل المثال، الخلايا السرطانية مقاومة للالتاكسين قد غيرت التعبير وظيفة الحوض β معينفي Ulin isotypes 5، 9، 19، 20، 21، 22، 23. باستخدام الأسلوب في الجسم الحي لقياس أنيبيب عدم الاستقرار الديناميكي، وتبين لنا أن، بالمقارنة مع غير مقاومة لل، الوالدين قدم مكعبة-7 خلايا CC 17، وديناميات أنيبيب من خلايا MCF-7 TXT مقاومة للDOCETAXEL لا تعير اهتماما للعلاج DOCETAXEL.
من أجل فهم أفضل وظيفة من الاتفاقات التجارية المتعددة الأطراف والآلية الدقيقة لالتاكسين المقاومة في الخلايا السرطانية، لا بد من قياس ديناميات أنيبيب. هنا، ونحن التقرير وسيلة في الجسم الحي للقيام بذلك. باستخدام التصوير الحي في تركيبة مع التعبير عن تويولين الموسومة GFP في الخلايا، يمكننا قياس ديناميات أنيبيب من قدم مكعبة-7 TXT وMCF-7 خلايا CC مع ووايthout العلاج DOCETAXEL. فإن النتائج يمكن أن تساعدنا في تصميم أدوية أكثر فعالية التي يمكن التغلب على مقاومة التاكسين.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك طريقتان الرئيسية لقياس أنيبيب عدم الاستقرار الديناميكي: في التجارب المختبرية والحية. في هذه الطريقة في المختبر، يتم استخدام تويولين تنقيته لقياس أنيبيب عدم الاستقرار الديناميكي مع مرور الزمن المجهر التفاضلية التدخل النقيض محسنة الكمبيوتر….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research is supported by funding from CBCF (to ZW).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Non-essential amino acids | Life Technologies, Invitrogen | 11140-050 | |
| FBS | Gibco, Invitrogen | 12483 | |
| Anti-Anti (100x) | Life Technologies, Invitrogen | 15240-062 | |
| docetaxel | Sigma-Aldrich | 01885-5mg-F | |
| DMEM phenol red-free | Gibco, Invitrogen | 21063 | |
| CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP-tubulin | ThermoFisher Scientific | C10613 | Key reagent for expressing GFP tubulin in cells |
| CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP | ThermoFisher Scientific | B10383 | Control |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich+B9:AA9 | 472301 | for dissoving decetaxel |
| 22-mm glass coveslip | Fisher Scientifics | 12-545-101 | |
| 6-well culture plate | Greiner Bio-One International | 6 Well Celi Culture Plate | |
| DeltaVision Microscopy Imaging Systems | GE Health | This system is equipped with weather station for controlling temperature and CO2. It also equipped with Worx Software for deconvolution and time lapse control. | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Bright-Line Hemacytometer Set, Hausser Scientific | Hausser Scientific, Distributed by VWR | Supplier No.: 1492 VWR No.:15170-172 |
References
- Kamangar, F., Dores, G. M., Anderson, W. F. Patterns of cancer incidence, mortality, and prevalence across five continents: defining priorities to reduce cancer disparities in different geographic regions of the world. J Clin Oncol. 24 (14), 2137-2150 (2006).
- Yardley, D. A. Drug resistance and the role of combination chemotherapy in improving patient outcomes. Int J Breast Cancer. 2013, 137414 (2013).
- Jassem, J., et al. Doxorubicin and paclitaxel versus fluorouracil, doxorubicin, and cyclophosphamide as first-line therapy for women with metastatic breast cancer: final results of a randomized phase III multicenter trial. J Clin Oncol. 19 (6), 1707-1715 (2001).
- Nabholtz, J. M., et al. Docetaxel and doxorubicin compared with doxorubicin and cyclophosphamide as first-line chemotherapy for metastatic breast cancer: results of a randomized, multicenter, phase III trial. J Clin Oncol. 21 (6), 968-975 (2003).
- Zelnak, A. Overcoming taxane and anthracycline resistance. Breast J. 16 (3), 309-312 (2010).
- Rivera, E. Implications of anthracycline-resistant and taxane-resistant metastatic breast cancer and new therapeutic options. Breast J. 16 (3), 252-263 (2010).
- Longley, D. B., Johnston, P. G. Molecular mechanisms of drug resistance. J Pathol. 205 (2), 275-292 (2005).
- Downing, K. H., Nogales, E. Crystallographic structure of tubulin: implications for dynamics and drug binding. Cell Struct.Funct. 24 (5), 269-275 (1999).
- McGrogan, B. T., Gilmartin, B., Carney, D. N., McCann, A. Taxanes, microtubules and chemoresistant breast cancer. Biochim.Biophys.Acta. 1785 (2), 96-132 (2008).
- Kamath, K., Oroudjev, E., Jordan, M. A. Determination of microtubule dynamic instability in living cells. Methods Cell Biol. 97, 1-14 (2010).
- Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9 (10), 790-803 (2010).
- Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nat.Rev.Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells?. J.Cell Sci. 122 (15), 2579-2585 (2009).
- Kavallaris, M. Microtubules and resistance to tubulin-binding agents. Nat.Rev.Cancer. 10 (3), 194-204 (2010).
- Diaz, J. F., Valpuesta, J. M., Chacon, P., Diakun, G., Andreu, J. M. Changes in microtubule protofilament number induced by Taxol binding to an easily accessible site. Internal microtubule dynamics. J.Biol.Chem. 273 (50), 33803-33810 (1998).
- Abal, M., Andreu, J. M., Barasoain, I. Taxanes: microtubule and centrosome targets, and cell cycle dependent mechanisms of action. Curr Cancer Drug Targets. 3 (3), 193-203 (2003).
- Wang, H., et al. Multiple mechanisms underlying acquired resistance to taxanes in selected docetaxel-resistant MCF-7 breast cancer cells. BMC Cancer. 14 (37), (2014).
- Lal, S., Mahajan, A., Chen, W. N., Chowbay, B. Pharmacogenetics of target genes across doxorubicin disposition pathway: a review. Curr. Drug Metab. 11 (1), 115-128 (2010).
- Murray, S., Briasoulis, E., Linardou, H., Bafaloukos, D., Papadimitriou, C. Taxane resistance in breast cancer: mechanisms, predictive biomarkers and circumvention strategies. Cancer Treat.Rev. 38 (7), 890-903 (2012).
- Kamath, K., Wilson, L., Cabral, F., Jordan, M. A. BetaIII-tubulin induces paclitaxel resistance in association with reduced effects on microtubule dynamic instability. J.Biol.Chem. 280 (13), 12902-12907 (2005).
- Banerjee, A. Increased levels of tyrosinated alpha-, beta(III)-, and beta(IV)-tubulin isotypes in paclitaxel-resistant MCF-7 breast cancer cells. Biochem.Biophys.Res.Commun. 293 (1), 598-601 (2002).
- Wiesen, K. M., Xia, S., Yang, C. P., Horwitz, S. B. Wild-type class I beta-tubulin sensitizes Taxol-resistant breast adenocarcinoma cells harboring a beta-tubulin mutation. Cancer Lett. 257 (2), 227-235 (2007).
- Iseri, O. D., Kars, M. D., Arpaci, F., Gunduz, U. Gene expression analysis of drug-resistant MCF-7 cells: implications for relation to extracellular matrix proteins. Cancer Chemother.Pharmacol. 65 (3), 447-455 (2010).
- Hembruff, S. L., et al. Role of drug transporters and drug accumulation in the temporal acquisition of drug resistance. BMC.Cancer. 8, 318 (2008).
- Yenjerla, M., Lopus, M., Wilson, L. Analysis of dynamic instability of steady-state microtubules in vitro by video-enhanced differential interference contrast microscopy with an appendix by Emin Oroudjev. Methods Cell Biol. 95, 189-206 (2010).
- Sammak, P. J., Gorbsky, G. J., Borisy, G. G. Microtubule dynamics in vivo: a test of mechanisms of turnover. J Cell Biol. 104 (3), 395-405 (1987).
- Walker, R. A., et al. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. J Cell Biol. 107 (4), 1437-1448 (1988).
- Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Annu Rev Cell Dev Biol. 13, 83-117 (1997).
- Walczak, C. E. Microtubule dynamics and tubulin interacting proteins. Curr Opin Cell Biol. 12 (1), 52-56 (2000).
