Imageamento ao vivo para estudar a instabilidade dinâmica dos microtúbulos em cânceres de mama resistentes a taxanos

Summary

In this paper, we report a protocol describing an in vivo method to measure microtubule dynamic instability in docetaxel-resistant breast cancer cells (MCF-7_TXT). In this method, a deconvolution microscopy imaging system is used to detect the expression of GFP-tubulin in target cells.

Abstract

Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane resistance in cancerous cells drastically reduces the effectiveness of the drugs’ long-term usage. Accumulated evidence suggests that the mechanisms underlying taxane resistance include both general mechanisms, such as the development of multidrug resistance due to the overexpression of drug-efflux proteins, and taxane-specific mechanisms, such as those that involve microtubule dynamics.

Because taxanes target cell microtubules, measuring microtubule dynamic instability is an important step in determining the mechanisms of taxane resistance and provides insight into how to overcome this resistance. In the experiment, an in vivo method was used to measure microtubule dynamic instability. GFP-tagged α-tubulin was expressed and incorporated into microtubules in MCF-7 cells, allowing for the recording of the microtubule dynamics by time lapse using a sensitive camera. The results showed that, as opposed to the non-resistant parental MCF-7_CC cells, the microtubule dynamics of docetaxel-resistant MCF-7_TXT cells are insensitive to docetaxel treatment, which causes the resistance to docetaxel-induced mitotic arrest and apoptosis. This paper will outline this in vivo method of measuring microtubule dynamic instability.

Introduction

A principal causa de mortalidade por câncer de mama é através de metástases ^{1, 2.} Os taxanos, como o docetaxel e o paclitaxel, são actualmente utilizados como esquemas de primeira linha para o tratamento de cancro da mama metastático ^{2, 3, 4, 5, 6.} Eles fazem parte de um grupo de agentes de metas de microtúbulos (MTA) que interrompem a dinâmica dos microtúbulos. No entanto, um dos maiores desafios para a utilização em terapia curativa taxanos é o desenvolvimento de resistência taxano em células de cancro, o que leva à recorrência da doença ^sete. A resistência às drogas é responsável por mais de 90% de todas as mortes entre os pacientes com câncer de mama metastático ^7.

Os microtúbulos são formados pela polimerização de heterodímeros a- e p-tubulinaclass = "xref"> ^{8, 9.} A regulação exacta da dinâmica dos microtúbulos é importante para muitas funções celulares, incluindo a célula de polarização, progressão do ciclo celular, o transporte intracelular e a sinalização celular. Desregulação dos microtúbulos e sua dinâmica irá interromper a função das células e resultar em morte celular ^{10, 11.} Dependendo de como eles causam esta desregulação, drogas MTA pode ser classificada quer como agentes de estabilização de microtúbulos (isto é, taxanos) ou agentes de microtúbulos-destabalizing (isto é, alcalóides vinca, colchicina ou local agentes de ligação) ^20. Apesar dos seus efeitos opostos sobre a massa de microtúbulos, numa dosagem suficiente, ambas as classes podem matar as células cancerosas através dos seus efeitos sobre a dinâmica dos microtúbulos ^21.

Os taxanos funcionar primariamente por estabilização de microtúbulos do fuso ^12, levando adesalinhamento cromossómico. A subsequente activação perpétua do checkpoint de montagem do fuso (SAC) prende a célula na mitose. Paragem da mitose prolongado, em seguida, faz com que a apoptose ^{13, 14.} Taxano interage com os microtúbulos através do sítio de ligação taxano em β-tubulina ^{8, 15,} que só está presente no tubulina montados ^16.

Vários mecanismos de resistência de taxano têm sido propostos ^{9, 17.} Estes mecanismos incluem tanto a resistência a múltiplas drogas em geral, devido à sobre-expressão de proteínas e de resistência ^{5, 9, 18, 19} específicos de taxano de droga-efluxo. Por exemplo, as células cancerosas resistentes a taxano podem ter alterado a expressão e função de certos β-banheiraUlin isotipos ^{5, 9, 19, 20, 21, 22, 23.} Ao usar um método in vivo para medir a instabilidade dinâmica dos microtúbulos, mostra-se que, quando comparado com a não-resistentes, parentais células MCF-7 _CC ^17, a dinâmica dos microtúbulos de células MCF-7 resistente ao _TXT docetaxel são insensíveis ao tratamento com docetaxel.

Para entender melhor a função de MTAs e o mecanismo exacto de taxano-resistência em células cancerosas, que é essencial para medir a dinâmica dos microtúbulos. Aqui, nós relatamos um método in vivo de fazê-lo. Utilizando imagens ao vivo em associação com a expressão de tubulina GFP em células, pode-se medir a dinâmica dos microtúbulos de células MCF-7 _TXT e células MCF-7 com _CC e without tratamento com docetaxel. Os resultados podem nos ajudar a projetar drogas mais eficazes que podem superar a resistência taxano.

Protocol

1. Preparar as células for Imaging ao vivo Cultura de células e sementeira Utilização de células MCF-7 de cancro da mama seleccionados para resistência ao docetaxel (MCF-7 TXT) e sua linha celular parental não resistente (MCF-7 CC). O processo de selecção detalhada e a caracterização destas linhas celulares seleccionadas foram descritos anteriormente 24. Cresça todas as células em placas de cultura de 10 cm a 37 ° …

Representative Results

Usando o protocolo aqui apresentado, foram estudados os efeitos do docetaxel sobre a dinâmica dos microtúbulos de (MCF-7) TXT células cancerosas de mama normal (MCF-7 CC) e docetaxel-resistente. Dois conjuntos de imagens mostram os efeitos do docetaxel (0,5 ^ M) sobre o crescimento e encurtamento dos microtúbulos em células MCF-7 CC e MCF-7 TXT células (Figura 1A). <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page=…

Discussion

Existem dois métodos principais para medir instabilidade dinâmica dos microtúbulos: in vitro e in vivo. No método in vitro, tubulina purificada é usada para medir a instabilidade dinâmica dos microtúbulos com microscopia de contraste de interferência diferencial-lapso de tempo melhorado-computador. No método in vivo, microinjectados tubulina fluorescente, ou expressaram a GFP-tubulina, é incorporado em microtúbulos. A dinâmica (crescimento e encurtamento) dos microtúbulos…

Materials

Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796
Non-essential amino acids	Life Technologies, Invitrogen	11140-050
FBS	Gibco, Invitrogen	12483
Anti-Anti (100x)	Life Technologies, Invitrogen	15240-062
docetaxel	Sigma-Aldrich	01885-5mg-F
DMEM phenol red-free	Gibco, Invitrogen	21063
CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP-tubulin	ThermoFisher Scientific	C10613	Key reagent for expressing GFP tubulin in cells
CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP	ThermoFisher Scientific	B10383	Control
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich+B9:AA9	472301	for dissoving decetaxel
22-mm glass coveslip	Fisher Scientifics	12-545-101
6-well culture plate	Greiner Bio-One International	6 Well Celi Culture Plate
DeltaVision Microscopy Imaging Systems	GE Health		This system is equipped with weather station for controlling temperature and CO2. It also equipped with Worx Software for deconvolution and time lapse control.
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	ThermoFisher Scientific	25200056
Bright-Line Hemacytometer Set, Hausser Scientific	Hausser Scientific, Distributed by VWR	Supplier No.: 1492 VWR No.:15170-172