Live-Imaging zur Untersuchung Mikrotubuli dynamische Instabilität in Taxan-resistenten Mammakarzinome

Summary

In this paper, we report a protocol describing an in vivo method to measure microtubule dynamic instability in docetaxel-resistant breast cancer cells (MCF-7_TXT). In this method, a deconvolution microscopy imaging system is used to detect the expression of GFP-tubulin in target cells.

Abstract

Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane resistance in cancerous cells drastically reduces the effectiveness of the drugs’ long-term usage. Accumulated evidence suggests that the mechanisms underlying taxane resistance include both general mechanisms, such as the development of multidrug resistance due to the overexpression of drug-efflux proteins, and taxane-specific mechanisms, such as those that involve microtubule dynamics.

Because taxanes target cell microtubules, measuring microtubule dynamic instability is an important step in determining the mechanisms of taxane resistance and provides insight into how to overcome this resistance. In the experiment, an in vivo method was used to measure microtubule dynamic instability. GFP-tagged α-tubulin was expressed and incorporated into microtubules in MCF-7 cells, allowing for the recording of the microtubule dynamics by time lapse using a sensitive camera. The results showed that, as opposed to the non-resistant parental MCF-7_CC cells, the microtubule dynamics of docetaxel-resistant MCF-7_TXT cells are insensitive to docetaxel treatment, which causes the resistance to docetaxel-induced mitotic arrest and apoptosis. This paper will outline this in vivo method of measuring microtubule dynamic instability.

Introduction

Die Haupttodesursache Brustkrebs ist durch Metastase ^{1, 2.} Taxane wie Docetaxel und Paclitaxel, werden derzeit als First-Line – Therapien bei der Behandlung von metastasierendem Brustkrebs ^{2, 3, 4, 5, 6} verwendet. Sie sind Teil einer Gruppe von Mikrotubuli-Targeting-Mittel (MTAs), die die Dynamik der Mikrotubuli stören. Allerdings ist eine der größten Herausforderungen für die Taxane in kurativen Therapie ist die Entwicklung von Taxan – Resistenz von Krebszellen unter Verwendung, die ⁷ bis Wiederauftreten der Krankheit führt. Arzneimittelresistenz ist für mehr als 90% aller Todesfälle bei Patienten mit metastasiertem Brustkrebs , ^7.

Mikrotubuli sind durch die Polymerisation von α- und β-Tubulin-Heterodimeren gebildetclass = "xref"> ^{8, 9.} Die genaue Regelung der Dynamik der Mikrotubuli ist wichtig für viele zelluläre Funktionen, einschließlich der Zellpolarisation, Zellzyklus, den intrazellulären Transport und Zellsignalisierung. Dysregulation von Mikrotubuli und deren Dynamik werden die Zellfunktion stören und führen in den Zelltod ^{10, 11.} Je nachdem , wie sie diese Dysregulation verursachen kann MTA Medikamente entweder als Mikrotubuli stabilisierende Mittel eingestuft werden (dh Taxane) oder Mikrotubuli-destabalizing Mittel (dh, Vinca – Alkaloiden oder Colchicin-Bindungsstelle Mittel) ^20. Trotz ihrer gegenläufigen Effekte auf Mikrotubuli Masse, bei einer ausreichenden Dosierung, beide Klassen können ²¹ Krebszellen durch ihre Auswirkungen auf die Dynamik der Mikrotubuli töten.

Taxane funktionieren in erster Linie durch die Mikrotubuli Spindel ¹² zu stabilisieren, was zuchromosomale Fehlausrichtung. Die anschließende unaufhörlichen Aktivierung der Spindelanordnung checkpoint (SAC) hemmt die Zelle in die Mitose. Längerer mitotischen Arrest bewirkt dann , dass die Apoptose ^{13, 14.} Taxan interagiert mit Mikrotubuli durch die Taxan – Bindungsstelle auf β-Tubulin – ^{8, 15,} die im zusammengebauten Tubulin ¹⁶ nur vorhanden ist.

Mehrere Mechanismen für Taxan Widerstand haben ^{9 vorgeschlagen, 17.} Diese Mechanismen umfassen sowohl allgemeine Multidrug – Resistenz durch die Überexpression von arzneimittel Efflux Proteine und Taxan-spezifischen Widerstand ^{5, 9, 18, 19.} Beispielsweise Taxan-resistenten Krebszellen Expression und Funktion bestimmter β-Tub möglicherweise verändertulin Isotypen ^{5, 9, 19, 20, 21, 22, 23.} Durch die Verwendung eines in vivo – Verfahren Mikrotubuli dynamische Instabilität zu messen, zeigen wir , dass, wenn im Vergleich zu nicht-resistenten, elterliche MCF-7 – Zellen _CC ¹⁷ die Mikrotubuli – Dynamik von Docetaxel-resistenten MCF-7 – Zellen zu _TXT Docetaxel Behandlung unempfindlich sind.

Zum besseren Verständnis der Funktion von MTAs und der genaue Mechanismus der Taxan-Resistenz in Krebszellen zu verstehen, ist es wichtig, die Dynamik der Mikrotubuli zu messen. Hier berichten wir über eine in vivo – Methode, dies zu tun. Durch die Verwendung von Echtzeit- Bildgebung in Kombination mit der Expression von GFP-markierten Tubulin in Zellen, können wir die Dynamik der Mikrotubuli von MCF-7 _TXT und MCF-7 _CC – Zellen mit und wi messenthout Behandlung mit Docetaxel. Die Ergebnisse können uns wirksamer Medikamente helfen entwerfen, die Taxan Widerstand überwinden kann.

Protocol

1. Vorbereitung der Zellen für Live-Imaging Zellkultur und Seeding Verwenden MCF-7 Brustkrebszellen , ausgewählt für die Resistenz gegen Docetaxel (MCF-7 TXT) und deren nicht-resistenten parentalen Zelllinie (MCF-7 CC). Die detaillierten Auswahlprozess und die Charakterisierung dieser ausgewählten Zelllinien wurden zuvor 24 beschrieben. Wachsen alle Zellen in 10 cm-Kulturschalen bei 37 ° C in einem Medium, 90% Dulbecco best…

Representative Results

Mit dem Protokoll hier vorgestellten, untersuchten wir die Wirkung von Docetaxel auf die Mikrotubuli – Dynamik der normalen (MCF-7 CC) und Docetaxel-resistenten (MCF-7 TXT) Brustkrebszellen. Zwei Sätze von Aufnahmen zeigen die Wirkung von Docetaxel (0,5 uM) auf Mikrotubuli Wachstum und Verkürzung in MCF-7 CC und MCF-7 – TXT – Zellen (1A). Wir auch die Geschwindigke…

Discussion

Es gibt zwei Hauptmethoden Mikrotubuli dynamische Instabilität zu messen: in vitro und in vivo. In dem in vitro – Verfahren wird gereinigtes Tubulin verwendet Mikrotubuli dynamische Instabilität mit Computer-enhanced Zeitrafferdifferentialinterferenzkontrastmikroskopie zu messen. In dem in vivo – Verfahren, mikroinjiziert Fluoreszenz Tubulin oder Tubulin-GFP exprimiert, in Mikrotubuli eingebaut. Die Dynamik (Wachstum und Verkürzung) der Mikrotubuli wird dann durch Zeitraffer unter …

Materials

Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796
Non-essential amino acids	Life Technologies, Invitrogen	11140-050
FBS	Gibco, Invitrogen	12483
Anti-Anti (100x)	Life Technologies, Invitrogen	15240-062
docetaxel	Sigma-Aldrich	01885-5mg-F
DMEM phenol red-free	Gibco, Invitrogen	21063
CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP-tubulin	ThermoFisher Scientific	C10613	Key reagent for expressing GFP tubulin in cells
CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP	ThermoFisher Scientific	B10383	Control
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich+B9:AA9	472301	for dissoving decetaxel
22-mm glass coveslip	Fisher Scientifics	12-545-101
6-well culture plate	Greiner Bio-One International	6 Well Celi Culture Plate
DeltaVision Microscopy Imaging Systems	GE Health		This system is equipped with weather station for controlling temperature and CO2. It also equipped with Worx Software for deconvolution and time lapse control.
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	ThermoFisher Scientific	25200056
Bright-Line Hemacytometer Set, Hausser Scientific	Hausser Scientific, Distributed by VWR	Supplier No.: 1492 VWR No.:15170-172