Imagerie en direct pour l'étude microtubules Instabilité dynamique dans les cancers du sein taxane-résistantes

Summary

In this paper, we report a protocol describing an in vivo method to measure microtubule dynamic instability in docetaxel-resistant breast cancer cells (MCF-7_TXT). In this method, a deconvolution microscopy imaging system is used to detect the expression of GFP-tubulin in target cells.

Abstract

Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane resistance in cancerous cells drastically reduces the effectiveness of the drugs’ long-term usage. Accumulated evidence suggests that the mechanisms underlying taxane resistance include both general mechanisms, such as the development of multidrug resistance due to the overexpression of drug-efflux proteins, and taxane-specific mechanisms, such as those that involve microtubule dynamics.

Because taxanes target cell microtubules, measuring microtubule dynamic instability is an important step in determining the mechanisms of taxane resistance and provides insight into how to overcome this resistance. In the experiment, an in vivo method was used to measure microtubule dynamic instability. GFP-tagged α-tubulin was expressed and incorporated into microtubules in MCF-7 cells, allowing for the recording of the microtubule dynamics by time lapse using a sensitive camera. The results showed that, as opposed to the non-resistant parental MCF-7_CC cells, the microtubule dynamics of docetaxel-resistant MCF-7_TXT cells are insensitive to docetaxel treatment, which causes the resistance to docetaxel-induced mitotic arrest and apoptosis. This paper will outline this in vivo method of measuring microtubule dynamic instability.

Introduction

La principale cause de mortalité par cancer du sein est par métastase ^{1, 2.} Taxanes, tels que le docétaxel et le paclitaxel, sont actuellement utilisés comme schémas de première intention dans le traitement du cancer du sein métastatique , ^{2, 3, 4, 5, 6.} Ils font partie d'un groupe d'agents de microtubules-ciblage (ATM) qui perturbent la dynamique des microtubules. Cependant, l' un des plus grands défis à l' utilisation de taxanes dans le traitement curatif est le développement de la résistance de taxane dans les cellules cancéreuses, ce qui conduit à la maladie récidive ^7. Représente la résistance aux médicaments pour plus de 90% de tous les décès chez les patients atteints d' un cancer du sein métastatique ^7.

Les microtubules sont formés par la polymérisation des hétérodimères a et ß-tubulineclass = "xref"> ^{8, 9.} La régulation précise de la dynamique des microtubules est important pour de nombreuses fonctions cellulaires, y compris la polarisation cellulaire, de la progression du cycle cellulaire, le transport intracellulaire et la signalisation cellulaire. Dysrégulation des microtubules et leur dynamique va perturber la fonction cellulaire et provoquer la mort cellulaire ^{10, 11.} Selon la façon dont ils provoquent cette dysrégulation, les médicaments MTA peuvent être classés comme des microtubules agents stabilisants ( par exemple, taxanes) ou agents microtubules destabalizing (ie, vinca – alcaloïdes ou colchicine site des agents de liaison) ^20. En dépit de leurs effets opposés sur la masse des microtubules, à une dose suffisante, les deux classes peuvent tuer les cellules cancéreuses grâce à leurs effets sur la dynamique des microtubules ^21.

Les taxanes fonctionnent principalement par la stabilisation de la broche microtubules ^12, conduisant àdésalignement chromosomique. L'activation perpétuelle ultérieure du point de contrôle de l'assemblage de broche (SAC) arrête la cellule en mitose. Prolongée mitotique arrestation provoque alors l' apoptose ^{13, 14.} Taxane interagit avec les microtubules par le biais du site de liaison du taxane sur la β-tubuline ^{8, 15,} qui est présent seulement dans la tubuline ¹⁶ assemblé.

Plusieurs mécanismes de résistance aux taxanes ont été proposées ^{9, 17.} Ces mécanismes comprennent à la fois la multirésistance générale due à la surexpression de protéines et spécifiques de taxane de la résistance ^{5, 9, 18, 19} médicaments efflux. Par exemple, les cellules cancéreuses résistantes à un taxane peut avoir modifié l'expression et la fonction de certaines β-tubulin isotypes ^{5, 9, 19, 20, 21, 22, 23.} En utilisant une méthode in vivo pour mesurer microtubules instabilité dynamique, on montre que, par rapport aux parents cellules MCF-7 non résistantes, _CC ^17, la dynamique des microtubules des cellules MCF-7 _TXT docétaxel résistantes sont insensibles à un traitement par le docétaxel.

Pour mieux comprendre la fonction de MTAs et le mécanisme exact de taxane-résistance dans les cellules cancéreuses, il est essentiel de mesurer la dynamique des microtubules. Nous rapportons ici une méthode in vivo de le faire. En utilisant l' imagerie en direct en combinaison avec l'expression de la tubuline GFP-marqués dans les cellules, nous pouvons mesurer la dynamique des microtubules de MCF-7 _TXT et MCF-7 cellules _CC avec et wiThoout traitement par le docétaxel. Les résultats peuvent nous aider à concevoir des médicaments plus efficaces qui peuvent surmonter la résistance de taxane.

Protocol

1. Préparation des cellules pour l'imagerie en direct La culture cellulaire et l' ensemencement Utiliser des cellules MCF-7 du cancer du sein sélectionnées pour la résistance au docétaxel (MCF-7 TXT) et leur lignée cellulaire parentale non résistante (MCF-7 CC). Le processus de sélection et la caractérisation détaillée de ces lignées cellulaires sélectionnées ont été décrites précédemment 24. </…

Representative Results

En utilisant le protocole présenté ici, nous avons étudié les effets de docétaxel sur la dynamique des microtubules de la normale (MCF-7 CC) et le docétaxel résistant (MCF-7) TXT cellules de cancer du sein. Deux séries d'images montrent les effets de docétaxel (0,5 uM) sur la croissance et le raccourcissement des microtubules dans les cellules MCF-7 CC et MCF-7 TXT cellules (figure 1A). <p class="jove_content" …

Discussion

Il existe deux méthodes principales pour mesurer microtubules instabilité dynamique: in vitro et in vivo. Dans le procédé in vitro, la tubuline purifiée est utilisée pour mesurer l' instabilité microtubules dynamique avec time-lapse interférence différentielle-microscopie à contraste amélioré par ordinateur. Dans le procédé in vivo, microinjecté tubuline fluorescente ou exprimé GFP-tubuline en microtubules est incorporé. La dynamique (croissance et de raccourcisse…

Materials

Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796
Non-essential amino acids	Life Technologies, Invitrogen	11140-050
FBS	Gibco, Invitrogen	12483
Anti-Anti (100x)	Life Technologies, Invitrogen	15240-062
docetaxel	Sigma-Aldrich	01885-5mg-F
DMEM phenol red-free	Gibco, Invitrogen	21063
CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP-tubulin	ThermoFisher Scientific	C10613	Key reagent for expressing GFP tubulin in cells
CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP	ThermoFisher Scientific	B10383	Control
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich+B9:AA9	472301	for dissoving decetaxel
22-mm glass coveslip	Fisher Scientifics	12-545-101
6-well culture plate	Greiner Bio-One International	6 Well Celi Culture Plate
DeltaVision Microscopy Imaging Systems	GE Health		This system is equipped with weather station for controlling temperature and CO2. It also equipped with Worx Software for deconvolution and time lapse control.
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	ThermoFisher Scientific	25200056
Bright-Line Hemacytometer Set, Hausser Scientific	Hausser Scientific, Distributed by VWR	Supplier No.: 1492 VWR No.:15170-172