Imágenes en vivo para el Estudio de la inestabilidad dinámica de microtúbulos en los cánceres de mama resistentes a taxano

Summary

In this paper, we report a protocol describing an in vivo method to measure microtubule dynamic instability in docetaxel-resistant breast cancer cells (MCF-7_TXT). In this method, a deconvolution microscopy imaging system is used to detect the expression of GFP-tubulin in target cells.

Abstract

Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane resistance in cancerous cells drastically reduces the effectiveness of the drugs’ long-term usage. Accumulated evidence suggests that the mechanisms underlying taxane resistance include both general mechanisms, such as the development of multidrug resistance due to the overexpression of drug-efflux proteins, and taxane-specific mechanisms, such as those that involve microtubule dynamics.

Because taxanes target cell microtubules, measuring microtubule dynamic instability is an important step in determining the mechanisms of taxane resistance and provides insight into how to overcome this resistance. In the experiment, an in vivo method was used to measure microtubule dynamic instability. GFP-tagged α-tubulin was expressed and incorporated into microtubules in MCF-7 cells, allowing for the recording of the microtubule dynamics by time lapse using a sensitive camera. The results showed that, as opposed to the non-resistant parental MCF-7_CC cells, the microtubule dynamics of docetaxel-resistant MCF-7_TXT cells are insensitive to docetaxel treatment, which causes the resistance to docetaxel-induced mitotic arrest and apoptosis. This paper will outline this in vivo method of measuring microtubule dynamic instability.

Introduction

La causa principal de la mortalidad del cáncer de mama es a través de la metástasis ^{1, 2.} Los taxanos, tales como docetaxel y paclitaxel, se utilizan actualmente como regímenes de primera línea en el tratamiento de cáncer de mama metastásico ^{2, 3, 4, 5, 6.} Son parte de un grupo de agentes de microtúbulos orientación (MTA) que interrumpen la dinámica de los microtúbulos. Sin embargo, uno de los mayores desafíos para el uso de taxanos en el tratamiento curativo es el desarrollo de resistencia a taxanos en células cancerosas, lo que conduce a la recurrencia de la enfermedad ^7. La resistencia a fármacos es responsable de más del 90% de todas las muertes entre los pacientes con cáncer de mama metastásico ^7.

Los microtúbulos se forman por la polimerización de heterodímeros alfa y beta tubulinaclass = "xref"> ^{8, 9.} La regulación precisa de la dinámica de microtúbulos es importante para muchas funciones celulares, incluyendo la polarización celular, progresión del ciclo celular, el transporte intracelular y la señalización celular. La desregulación de los microtúbulos y su dinámica va a alterar la función celular y provocar la muerte celular ^{10, 11.} Dependiendo de la forma en que causan este desregulación, drogas MTA se pueden clasificar como agentes estabilizantes de microtúbulos (es decir, taxanos) o agentes de microtúbulos destabalizing (es decir, alcaloides de la vinca o la colchicina-sitio de agentes de unión) ^20. A pesar de sus efectos opuestos sobre la masa de los microtúbulos, a una dosis suficiente, ambas clases pueden matar a las células cancerosas a través de sus efectos sobre la dinámica de los microtúbulos ^21.

Los taxanos funcionan principalmente mediante la estabilización de los microtúbulos del huso ^12, que conduce adesalineación cromosómico. La activación perpetua posterior de la asamblea de control de huso (SAC) detiene el celular en la mitosis. Mitótico detención prolongada provoca entonces la apoptosis ^{13, 14.} Taxano interactúa con los microtúbulos a través del sitio de unión de taxano en β-tubulina ^{8, 15,} que sólo está presente en tubulina ensamblada ^16.

Se han propuesto múltiples mecanismos de resistencia taxano ^{9, 17.} Estos mecanismos incluyen tanto resistencia a múltiples fármacos en general debido a la sobreexpresión de las proteínas y los taxanos específico resistencia ^{5, 9, 18, 19} de flujo de salida con las drogas. Por ejemplo, las células cancerosas resistentes a taxanos puede haber alterado la expresión y la función de determinadas β-bañeraUlin isotipos ^{5, 9, 19, 20, 21, 22, 23.} Mediante el uso de un método in vivo para medir la inestabilidad dinámica de los microtúbulos, se muestra que, en comparación con, células MCF-7 _CC parentales no resistentes ^17, la dinámica de los microtúbulos de células MCF-7 _TXT docetaxel resistentes son insensibles al tratamiento con docetaxel.

Para entender mejor la función de los ATM y el mecanismo exacto de taxano-resistencia en las células cancerosas, es esencial para medir la dinámica de microtúbulos. Aquí, se presenta un método in vivo de hacerlo. Mediante el uso de imágenes en vivo en combinación con la expresión de la tubulina marcado con GFP en las células, podemos medir la dinámica de los microtúbulos de las células MCF-7 _TXT y células MCF-7 con _CC y wiThout tratamiento con docetaxel. Los resultados pueden ayudar a diseñar fármacos más efectivos que puedan superar la resistencia taxano.

Protocol

1. Preparación de las células de imágenes en vivo Cultivo de células y la siembra Utilice células MCF-7 de cáncer de mama seleccionados para la resistencia a docetaxel (MCF-7 TXT) y su línea celular parental no resistentes (MCF-7 CC). El proceso de selección detallada y la caracterización de estas líneas celulares seleccionadas se han descrito anteriormente 24. Crecer todas las células en placas de cultivo de 10 cm a …

Representative Results

Utilizando el protocolo presentado aquí, se estudiaron los efectos de docetaxel en la dinámica de los microtúbulos de normal (MCF-7 CC) y docetaxel resistentes (MCF-7 TXT) las células de cáncer de mama. Dos conjuntos de imágenes muestran los efectos de docetaxel (0,5 M) en el crecimiento de los microtúbulos y la manteca en MCF-7 CC y MCF-7 TXT células (Figura 1A). <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page…

Discussion

Hay dos métodos principales para medir la inestabilidad dinámica de los microtúbulos in vitro y en vivo. En el método in vitro, la tubulina purificada se utiliza para medir la inestabilidad dinámica de los microtúbulos con lapso de tiempo diferencial de interferencia de microscopía de contraste mejorado por computadora. En el método in vivo, microinyectó tubulina fluorescente, o se expresa GFP-tubulina, se incorpora en los microtúbulos. La dinámica (crecimiento y acortamien…

Materials

Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796
Non-essential amino acids	Life Technologies, Invitrogen	11140-050
FBS	Gibco, Invitrogen	12483
Anti-Anti (100x)	Life Technologies, Invitrogen	15240-062
docetaxel	Sigma-Aldrich	01885-5mg-F
DMEM phenol red-free	Gibco, Invitrogen	21063
CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP-tubulin	ThermoFisher Scientific	C10613	Key reagent for expressing GFP tubulin in cells
CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP	ThermoFisher Scientific	B10383	Control
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich+B9:AA9	472301	for dissoving decetaxel
22-mm glass coveslip	Fisher Scientifics	12-545-101
6-well culture plate	Greiner Bio-One International	6 Well Celi Culture Plate
DeltaVision Microscopy Imaging Systems	GE Health		This system is equipped with weather station for controlling temperature and CO2. It also equipped with Worx Software for deconvolution and time lapse control.
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	ThermoFisher Scientific	25200056
Bright-Line Hemacytometer Set, Hausser Scientific	Hausser Scientific, Distributed by VWR	Supplier No.: 1492 VWR No.:15170-172