خلايا الإنسان الجذعية الرئة: التوزيع المكاني والمظهري تحديد في داخل القصبة التحليلات عن طريق المناعية والتدفق الخلوي
Summary
Lung-resident immune cells, including dendritic cells (DCs) in humans, are critical for defense against inhaled pathogens and allergens. However, due to the scarcity of human lung tissue, studies are limited. This work presents protocols to process human mucosal endobronchial biopsies for studying lung DCs using immunohistochemistry and flow cytometry.
Abstract
The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In order to maintain tolerance or to induce an immune response, the immune system must appropriately handle inhaled antigens. Lung dendritic cells (DCs) are essential in maintaining a delicate balance to initiate immunity when required without causing collateral damage to the lungs due to an exaggerated inflammatory response. While there is a detailed understanding of the phenotype and function of immune cells such as DCs in human blood, the knowledge of these cells in less accessible tissues, such as the lungs, is much more limited, since studies of human lung tissue samples, especially from healthy individuals, are scarce. This work presents a strategy to generate detailed spatial and phenotypic characterization of lung tissue resident DCs in healthy humans that undergo a bronchoscopy for the sampling of endobronchial biopsies. Several small biopsies can be collected from each individual and can be subsequently embedded for ultrafine sectioning or enzymatically digested for advanced flow cytometric analysis. The outlined protocols have been optimized to yield maximum information from small tissue samples that, under steady-state conditions, contain only a low frequency of DCs. While the present work focuses on DCs, the methods described can directly be expanded to include other (immune) cells of interest found in mucosal lung tissue. Furthermore, the protocols are also directly applicable to samples obtained from patients suffering from pulmonary diseases where bronchoscopy is part of establishing the diagnosis, such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD), sarcoidosis, or lung cancer.
Introduction
الرئتين على اتصال مستمر مع البيئة الخارجية ويتعرضون للغاية لكلا جزيئات غير ضارة والميكروبات مع القدرة على التسبب في المرض. لذلك، من المهم جدا لجهاز المناعة لتركيب الاستجابات المناعية فعالة ضد الجراثيم الغازية، ولكن من المهم أيضا للحفاظ على التسامح لمستضدات استنشاقه التي لا تسبب المرض. لتوفير المراقبة المناعة قوية، واصطف الجهاز التنفسي مع وجود شبكة من الخلايا المناعية، بما في ذلك الخلايا الجذعية (DCS). البلدان النامية هي المهنية الخلايا المقدمة للمستضد مع قدرة فريدة على تنشيط خلايا T ساذجة. في الرئتين الإنسان، البلدان النامية المقيمين تواجه مستضد ومن ثم معالجة ونقل ذلك إلى الغدد الليمفاوية استنزاف الرئة لعرضها على وتنشيط خلايا T 1، 2، 3.
في نظام المناعة البشري، البلدان النامية يمكن تقسيمها إلى عدة مجموعات فرعية، مع ديستانط م ولكن تداخل وظائف: CD1c + وCD141 + البلدان النامية الدم النخاعي (MDCs) وCD123 + البلدان النامية بلازماوية الشكل (PDCS) 4، 5. في حين أن معظم المعرفة التفصيلية على البلدان النامية الإنسان تنبع من الدراسات في الدم، فمن الواضح الآن أن الرئتين الإنسان أيضا تؤوي السكان نادر من مجموعات فرعية العاصمة مع خلايا T قدرة تنشيطية 6، 7، 8، 9. ومع ذلك، تشير البيانات المتراكمة التي الخلايا المناعية، بما في ذلك البلدان النامية، تختلف في تكرارها، النمط الظاهري، وظيفة اعتمادا على الموقع التشريحي من 10. وبالتالي، فمن المهم دراسة الخلايا المناعية من الأنسجة ذات الصلة لفهم مساهمتها في الحصانة المحلية والتسامح. أخذت معا، وهذا يؤكد الحاجة لدراسة البلدان النامية والرئة المقيمين عند معالجة أمراض الرئة، على الرغم من البلدان النامية الدم يجري أكثر متوفرة بسهولة والوصول إليها في البشر.
أولى الدراسات التي حققت البلدان النامية والرئة المقيمين في البشر تعتمد في المقام الأول على التشكل والتعبير عن علامات واحدة، مثل HLA-DR وCD11c و، في أقسام الأنسجة باستخدام المناعية 11، 12، 13. في المقابل، المزيد من الدراسات الحديثة تعتمد عادة على cytometric تدفق التحليلات لدراسة مختلف مجموعات فرعية الخلايا المناعية. ومع ذلك، نظرا لأنه من الصعب العثور على علامة سطح الخلية واحدة أن يعرف بشكل فريد مجموعة فرعية العاصمة محددة، والحد المحتمل للدراسات تطبق فقط أربعة ألوان قياس التدفق الخلوي هو خطر بما في ذلك سكان الخلية مع علامات المظهرية مماثلة لبلدان النامية. على سبيل المثال، يتم التعبير عن CD11c وعلى كافة DC الدم النخاعي، والغالبية العظمى من وحيدات. من ناحية أخرى، في الدراسات التي تطبق أكثر تقدما لوحات التدفق الخلوي، استخدمت أنسجة الرئة غير سرطانية من استئصال الجراحي للمرضى عادةXREF "> 10، 14، 15، 16، على الرغم من أنه من غير الواضح ما إذا كان هؤلاء السكان نادرة تمثل فعلا البلدان النامية موجودة في الاشخاص الاصحاء. وعموما، هناك دراسات محدودة إلى حد كبير يرجع ذلك إلى حقيقة أن ازالتها جراحيا أو كاملة أنسجة الرئة البشرية الشحيحة.
للتغلب على بعض من هذه القيود، ويصف هذا العمل كيفية إجراء تحليل مفصل لتوزيع المكاني وتحديد المظهري من البلدان النامية في الخزعات ضمن القصبة المخاطية التي تم الحصول عليها من المتطوعين الأصحاء الذين خضعوا لتنظير القصبات. عدة خزعات صغيرة يمكن جمعها من كل فرد، ويمكن بعد ذلك أن جزءا لا يتجزأ من لباجتزاء والتحليل باستخدام المناعية أو إنزيمي هضمها لتحليل تدفق cytometric المتقدمة. باستخدام أنسجة الرئة في شكل خزعات ضمن القصبة تم الحصول عليها من bronchoscopies يمنح ميزة مما يجعل من الممكن لأداء الحاديudy على متطوعين أصحاء، على عكس الجراحة المفتوحة للرئتين، لأسباب واضحة، ويقتصر على المرضى التي تتطلب جراحة الصدر. وعلاوة على ذلك، فإن الأنسجة التي أخذت عينات خلال القصبات من المتطوعين الأصحاء أمر طبيعي من الناحية الفسيولوجية، على النقيض من منطقة غير المتضررة من أنسجة الرئة في المرضى الذين يعانون من مرض رئوي. من ناحية أخرى، الخزعات صغيرة وعدد الخلايا التي تم استردادها، حتى عندما تجمع عدة خزعات، يحد نوع من التحليلات التي يمكن القيام بها.
في حين يركز هذا العمل على البلدان النامية، والأساليب المذكورة يمكن توسيعها مباشرة لتشمل عددا آخر من الخلايا (المناعة) من الفائدة الموجودة في الأنسجة المخاطية رئة الإنسان. وعلاوة على ذلك، فإن البروتوكولات هي أيضا قابلة للتطبيق مباشرة لعينات تم الحصول عليها من المرضى الذين يعانون من أمراض رئوية حيث القصبات هي جزء من وضع التشخيص، مثل مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD)، الساركويد، أو سرطان الرئة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتصف هذه الورقة كيفية إنشاء توصيف المكاني وphenotypical مفصل من الرئة البلدان النامية الأنسجة المقيمين في البشر صحية باستخدام المناعية والتدفق الخلوي على خزعات المخاطية داخل القصبة التي تم جمعها خلال تنظير القصبات. في الفقرات التالية تناقش الخطوات الحاسمة في البروتوكول…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر المتطوعين الذين ساهموا المواد السريرية لهذه الدراسة. ونحن أيضا ممتنون للموظفين في وزارة الصحة العامة والطب السريري، شعبة الطب / طب الجهاز التنفسي في مستشفى جامعة، أوميا (Norrlands universitetssjukhus) لجمع جميع المواد السريرية.
وأيد هذا العمل عن طريق منح ل AS-S من مجلس السويدية البحوث، والمؤسسة السويدية القلب والرئة، والمؤسسة السويدية للأبحاث الاستراتيجية، ومعهد كارولينسكا.
Materials
| Bronchoscopy | |||
| Bronchoscope BF1T160 | Olympus | BF1T160 | |
| Light source | Olympus | Exera CV-160 | |
| Fenestrated forceps | Olympus | FB21C | Used to take biopsies |
| Bite Block | Conmed | 1429 | 20x27mm |
| Glucose 25% | 500mL intravenous | ||
| Glycopyrronium bromide 0.2mg/mL | Intravenous. Prevents mucus/saliva secretion | ||
| Mixt. Midazolam 1mg/mL p.o | Can be used for extra relaxation | ||
| Lidocaine, 40mg/mL | Mouth and throat administration / Gargled | ||
| Lidocaine 100mg/ml spray | Administered to back of throat | ||
| Lidocaine 20mg/ml spray | Administered via bronchoscope to airways | ||
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| GMA processing and embedding | |||
| Glass vials | 5mL | ||
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201-1L | |
| Molecular sieves, 4A | Alfa Aesar | 88120 | 3-4mm diameter pellets |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P-7626 | 0.035g/100ml acetone |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I-6125 | 0.37g/100ml acetone |
| Polythene-flat TAAB embedding capsules | TAAB laboratories | C094 | x500 8mm diameter, polythene, flat-bottom capsules |
| Capsule holder | TAAB laboratories | C054 | Holds 25 8mm capsules |
| JB-4 GMA embedding kit | Polysciences | 00226 | Contains JB-4 Solution A (0026A-800), JB-4 solution B (0026B-3.8), benzoyl peroxide (02618-12) |
| Methyl benzoate | Sigma-Aldrich | 27614-1L | |
| Silica gel with humidity indicator | Scharlau | GE0043 | 2.5-6mm |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| GMA sectioning | |||
| Glass microscope slides | ThermoFisher Scientific | 10143562CEF | Cut edges, frosted end |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920-500mL | 1:10 for working solution |
| Sheet glass strips for ultramicrotomy | Alkar | ||
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | Wash solution (0.1% Tween20) |
| LKB 7800B Knifemaker | LKB | ||
| Capsule splitter | TAAB laboratories | C065 | |
| Carbon steel single edge blades | TAAB laboratories | B054 | |
| Vice | |||
| Ammonia, 25% | VWR | 1133.1000 | 2mL in 1L, 1:500 (0.05%) |
| Microtome | Leica | Leica RM 2165 | |
| Light source | Leica | Leica CLS 150 XE | |
| Microscope with swing arm stand | Leica | Leica MZ6 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| GMA Immunohistochemistry | |||
| Diamond tipped pen | Histolab | 5218 | |
| Hydrogen peroxide 30% solution | AnalaR Normapur | 23619.264 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Tris | Roche | 10708976001 | |
| Sodium chloride | VWR chemicals | 27810.295 | |
| Bovine serum albumin | Millipore | 82-045-2 | Probumin BSA diagnostic grade |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| Anti-human CD45 antibody | BioLegend | 304002 | Mouse monoclonal, clone HI30, isotype IgG1k. Working concentration of 500 ng/ml |
| Anti-human CD1a antibody | AbD Serotech | MCA80GA | Mouse monoclonal, clone NA1/34-HLK, isotype IgG2a. Working concentration of 10 µg/ml |
| Mouse monoclonal IgG1 isotype control | Abcam | ab27479 | |
| Mouse monoclonal IgG2a isotype control | Dako | X094301-2 | |
| Vectastain ABC Elite standard kit | Vector Labs | PK-6100 | |
| AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) peroxidase substrate kite | Vector Labs | SK-4200 | |
| Mayers haematoxylin | HistoLab | 01820 | |
| Permanent Aqueous Mounting Medium | AbD Serotech | BUF058C | |
| Drying oven | |||
| DPX permanent mounting solution | VWR | 360292F | |
| Light microscope | Leica | Leica DMLB | |
| Microscope camera | Leica | Leica DFC 320 | |
| Analysis software | Leica | Leica Qwin V3 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Enzymatic digestion | |||
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | 55021C | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| Collagenase II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | 10104159001 ROCHE | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Forceps | |||
| Platform rocker | Grant instruments | PMR-30 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 14-432-22 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Flow cytometry | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| LIVE/DEAD Aqua fixable dead cell stain kit | Life Technologies | L34957 | |
| CD45 | BD | 555485 | |
| CD3 | BD | 557757 | |
| CD20 | BD | 335829 | |
| CD56 | Biolegend | 318332 | |
| CD66abce | Miltenyi | 130-101-132 | |
| HLA-DR | BD | 555813 | |
| CD14 | BD | 557831 | |
| CD16 | Biolegend | 302026 | |
| CD11c | BD | 560369 | |
| CD1c | Miltenyi | 130-098-009 | |
| CD141 | Miltenyi | 130-090-514 | |
| CD103 | Biolegend | 350212 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| LSR II Flow cytometer | BD | Flow cytometer | |
| FlowJo | FlowJo | Software for analysis |
References
- Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).
- Condon, T. V., Sawyer, R. T., Fenton, M. J., Riches, D. W. Lung dendritic cells at the innate-adaptive immune interface. J Leukoc Biol. 90 (5), 883-895 (2011).
- Lambrecht, B. N., Hammad, H. Biology of lung dendritic cells at the origin of asthma. Immunity. 31 (3), 412-424 (2009).
- Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems. Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).
- Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116 (16), e74-e80 (2010).
- Demedts, I. K., Brusselle, G. G., Vermaelen, K. Y., Pauwels, R. A. Identification and characterization of human pulmonary dendritic cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 32 (3), 177-184 (2005).
- Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D. Identification rare-event detection and analysis of dendritic cell subsets in broncho-alveolar lavage fluid and peripheral blood by flow cytometry. Front Biosci. 8, s1175-s1180 (2003).
- Masten, B. J., et al. Characterization of myeloid and plasmacytoid dendritic cells in human lung. J Immunol. 177 (11), 7784-7793 (2006).
- Ten Berge, B., et al. A novel method for isolating dendritic cells from human bronchoalveolar lavage fluid. J Immunol Methods. 351 (1-2), 13-23 (2009).
- Yu, C. I., et al. Human CD1c+ dendritic cells drive the differentiation of CD103+ CD8+ mucosal effector T cells via the cytokine TGF-beta. Immunity. 38 (4), 818-830 (2013).
- Nicod, L. P., Lipscomb, M. F., Toews, G. B., Weissler, J. C. Separation of potent and poorly functional human lung accessory cells based on autofluorescence. J Leukoc Biol. 45 (5), 458-465 (1989).
- Sertl, K., et al. Dendritic cells with antigen-presenting capability reside in airway epithelium, lung parenchyma, and visceral pleura. J Exp Med. 163 (2), 436-451 (1986).
- van Haarst, J. M., de Wit, H. J., Drexhage, H. A., Hoogsteden, H. C. Distribution and immunophenotype of mononuclear phagocytes and dendritic cells in the human lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 10 (5), 487-492 (1994).
- Schlitzer, A., et al. IRF4 transcription factor-dependent CD11b+ dendritic cells in human and mouse control mucosal IL-17 cytokine responses. Immunity. 38 (5), 970-983 (2013).
- Yu, Y. A., et al. Flow Cytometric Analysis of Myeloid Cells in Human Blood, Bronchoalveolar Lavage, and Lung Tissues. Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).
- Haniffa, M., et al. Human tissues contain CD141hi cross-presenting dendritic cells with functional homology to mouse CD103+ nonlymphoid dendritic cells. Immunity. 37 (1), 60-73 (2012).
- Britten, K. M., Howarth, P. H., Roche, W. R. Immunohistochemistry on resin sections: a comparison of resin embedding techniques for small mucosal biopsies. Biotech Histochem. 68 (5), 271-280 (1993).
- Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).
- Baharom, F., et al. Dendritic Cells and Monocytes with Distinct Inflammatory Responses Reside in Lung Mucosa of Healthy Humans. J Immunol. 196 (11), 4498-4509 (2016).
- Salvi, S., et al. Acute inflammatory responses in the airways and peripheral blood after short-term exposure to diesel exhaust in healthy human volunteers. Am J Respir Crit Care Med. 159 (3), 702-709 (1999).
- Schon-Hegrad, M. A., Oliver, J., McMenamin, P. G., Holt, P. G. Studies on the density, distribution, and surface phenotype of intraepithelial class II major histocompatibility complex antigen (Ia)-bearing dendritic cells (DC) in the conducting airways. J Exp Med. 173 (6), 1345-1356 (1991).
- Saeys, Y., Gassen, S. V., Lambrecht, B. N. Computational flow cytometry: helping to make sense of high-dimensional immunology data. Nat Rev Immunol. 16 (7), 449-462 (2016).
