Las células dendríticas humanas de pulmón: distribución espacial y fenotípica de identificación en endobronquial biopsias mediante inmunohistoquímica y citometría de flujo
Summary
Lung-resident immune cells, including dendritic cells (DCs) in humans, are critical for defense against inhaled pathogens and allergens. However, due to the scarcity of human lung tissue, studies are limited. This work presents protocols to process human mucosal endobronchial biopsies for studying lung DCs using immunohistochemistry and flow cytometry.
Abstract
The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In order to maintain tolerance or to induce an immune response, the immune system must appropriately handle inhaled antigens. Lung dendritic cells (DCs) are essential in maintaining a delicate balance to initiate immunity when required without causing collateral damage to the lungs due to an exaggerated inflammatory response. While there is a detailed understanding of the phenotype and function of immune cells such as DCs in human blood, the knowledge of these cells in less accessible tissues, such as the lungs, is much more limited, since studies of human lung tissue samples, especially from healthy individuals, are scarce. This work presents a strategy to generate detailed spatial and phenotypic characterization of lung tissue resident DCs in healthy humans that undergo a bronchoscopy for the sampling of endobronchial biopsies. Several small biopsies can be collected from each individual and can be subsequently embedded for ultrafine sectioning or enzymatically digested for advanced flow cytometric analysis. The outlined protocols have been optimized to yield maximum information from small tissue samples that, under steady-state conditions, contain only a low frequency of DCs. While the present work focuses on DCs, the methods described can directly be expanded to include other (immune) cells of interest found in mucosal lung tissue. Furthermore, the protocols are also directly applicable to samples obtained from patients suffering from pulmonary diseases where bronchoscopy is part of establishing the diagnosis, such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD), sarcoidosis, or lung cancer.
Introduction
Los pulmones están en contacto continuo con el medio externo y están muy expuestas a ambas partículas inofensivas y microbios con la capacidad de causar la enfermedad. Por lo tanto, es crítico para el sistema inmune para montar respuestas inmunes potentes contra los patógenos invasores, pero es igualmente importante para mantener la tolerancia a los antígenos inhalados que no causan enfermedad. Para proporcionar la vigilancia inmune potente, el sistema respiratorio se alinea con una red de células inmunes, incluyendo células dendríticas (DC). DC son células presentadoras de antígeno profesionales con la capacidad única de activar las células T vírgenes. En los pulmones humanos, DCs residentes encuentran un antígeno y entonces el proceso y lo transportan a los ganglios linfáticos pulmonares de drenaje para su presentación a y activación de células T 1, 2, 3.
En el sistema inmune humano, los DC se puede dividir en varios subconjuntos, con Distinct pero superpuestas funciones: CD1c + y CD141 + DC mieloides (PMD) y CD123 + plasmacytoid países en desarrollo (PDC) 4, 5. Mientras que la mayoría conocimiento detallado en países en desarrollo humano se deriva de estudios en la sangre, es ahora evidente que los pulmones humanos también albergan poblaciones raras de subconjuntos de DC con las células T capacidad estimuladora 6, 7, 8, 9. Sin embargo, la acumulación de datos muestran que las células inmunes, incluyendo países en desarrollo, difieren en su frecuencia, fenotipo y función dependiendo de su ubicación anatómica 10. Por lo tanto, es importante para estudiar las células inmunes del tejido relevante para entender su contribución a la inmunidad local y la tolerancia. En conjunto, esto pone de relieve la necesidad de estudiar las CD pulmonares residente hora de abordar las enfermedades pulmonares, a pesar de ser más fácilmente disponible y accesible sangre países en desarrollo en humanos.
Los primeros estudios que investigaron las CD pulmonares residente en el ser humano se basó principalmente en la morfología y la expresión de marcadores individuales, tales como HLA-DR y CD11c, en secciones de tejido mediante inmunohistoquímica 11, 12, 13. Por el contrario, los estudios más recientes se han basado generalmente en los análisis de citometría de flujo para estudiar diferentes subconjuntos de células inmunes. Sin embargo, ya que es difícil encontrar un solo marcador de la superficie celular que identifica de forma única un subconjunto específico de CC, la limitación potencial de los estudios aplicando citometría de flujo de cuatro colores solamente es el riesgo de incluir poblaciones de células con marcadores fenotípicos similares a los de los países en desarrollo. Por ejemplo, CD11c se expresa en todos los DC mieloides y la gran mayoría de los monocitos. Por otro lado, en los estudios de la aplicación de los paneles de citometría de flujo más avanzados, el tejido pulmonar no canceroso de resecciones quirúrgicas de los pacientes se usa típicamentexref "> 10, 14, 15, 16, aunque no está claro si estas poblaciones raras son verdaderamente representativa de los DC presente en los sujetos sanos. En general, los estudios se limitan en gran parte debido al hecho de que quirúrgicamente eliminado o tejido pulmonar humano completo es escasa.
Para superar algunas de estas limitaciones, este trabajo describe cómo realizar un análisis detallado de la distribución espacial y una identificación fenotípica de los países en desarrollo en las biopsias de mucosa de la mucosa obtenidas de voluntarios sanos que se someten a una broncoscopia. Varios biopsias pequeñas se pueden recoger de cada individuo y, posteriormente, se pueden incorporar para seccionar y el análisis mediante inmunohistoquímica o enzimáticamente digerido para el análisis avanzado de citometría de flujo. El uso de tejido pulmonar en la forma de la biopsia endobronquial obtenidos de broncoscopias confiere la ventaja de hacer posible la realización de la study en voluntarios sanos, a diferencia de la cirugía abierta de los pulmones que, por razones obvias, se limita a los pacientes que requieren cirugía torácica. Además, el tejido que se muestrea durante una broncoscopia de voluntarios sanos es fisiológicamente normal, en contraste con un área no afectada del tejido pulmonar en pacientes con una enfermedad pulmonar. Por otro lado, las biopsias son pequeñas y el número de células recuperadas, incluso cuando la agrupación de varias biopsias, limita el tipo de análisis que se pueden realizar.
Mientras que el presente trabajo se centra en los países en desarrollo, los métodos descritos se puede ampliar directamente a incluyen otras células (inmunes) de interés que residen en el tejido de la mucosa de pulmón humano. Además, los protocolos son también directamente aplicables a muestras obtenidas de pacientes que padecen enfermedades pulmonares donde broncoscopia es parte de establecer el diagnóstico, tales como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), sarcoidosis, o cáncer de pulmón.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este documento se describe cómo generar una caracterización espacial y fenotípica detallada de las CD pulmonares de tejido residentes en los seres humanos sanos mediante inmunohistoquímica y citometría de flujo en biopsias de la mucosa endobronquiales recogidos durante la broncoscopia. En los párrafos siguientes pasos críticos en el protocolo se discuten en detalle.
Los pasos críticos con el Protocolo
Seccionamiento e inmunohistoquímica: Es fundamental p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a los voluntarios que han contribuido con material clínico de este estudio. También estamos agradecidos al personal del Departamento de Salud Pública y Medicina Clínica, División de Medicina Medicina / Respiratoria del Hospital Universitario de Umea (Norrlands universitetssjukhus) para la recogida de todo el material clínico.
Este trabajo fue apoyado por becas de AS-S desde el Consejo Sueco de Investigación, la Fundación Sueca de Corazón y Pulmón, la Fundación Sueca para la Investigación Estratégica, y el Instituto Karolinska.
Materials
| Bronchoscopy | |||
| Bronchoscope BF1T160 | Olympus | BF1T160 | |
| Light source | Olympus | Exera CV-160 | |
| Fenestrated forceps | Olympus | FB21C | Used to take biopsies |
| Bite Block | Conmed | 1429 | 20x27mm |
| Glucose 25% | 500mL intravenous | ||
| Glycopyrronium bromide 0.2mg/mL | Intravenous. Prevents mucus/saliva secretion | ||
| Mixt. Midazolam 1mg/mL p.o | Can be used for extra relaxation | ||
| Lidocaine, 40mg/mL | Mouth and throat administration / Gargled | ||
| Lidocaine 100mg/ml spray | Administered to back of throat | ||
| Lidocaine 20mg/ml spray | Administered via bronchoscope to airways | ||
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| GMA processing and embedding | |||
| Glass vials | 5mL | ||
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201-1L | |
| Molecular sieves, 4A | Alfa Aesar | 88120 | 3-4mm diameter pellets |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P-7626 | 0.035g/100ml acetone |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I-6125 | 0.37g/100ml acetone |
| Polythene-flat TAAB embedding capsules | TAAB laboratories | C094 | x500 8mm diameter, polythene, flat-bottom capsules |
| Capsule holder | TAAB laboratories | C054 | Holds 25 8mm capsules |
| JB-4 GMA embedding kit | Polysciences | 00226 | Contains JB-4 Solution A (0026A-800), JB-4 solution B (0026B-3.8), benzoyl peroxide (02618-12) |
| Methyl benzoate | Sigma-Aldrich | 27614-1L | |
| Silica gel with humidity indicator | Scharlau | GE0043 | 2.5-6mm |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| GMA sectioning | |||
| Glass microscope slides | ThermoFisher Scientific | 10143562CEF | Cut edges, frosted end |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920-500mL | 1:10 for working solution |
| Sheet glass strips for ultramicrotomy | Alkar | ||
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | Wash solution (0.1% Tween20) |
| LKB 7800B Knifemaker | LKB | ||
| Capsule splitter | TAAB laboratories | C065 | |
| Carbon steel single edge blades | TAAB laboratories | B054 | |
| Vice | |||
| Ammonia, 25% | VWR | 1133.1000 | 2mL in 1L, 1:500 (0.05%) |
| Microtome | Leica | Leica RM 2165 | |
| Light source | Leica | Leica CLS 150 XE | |
| Microscope with swing arm stand | Leica | Leica MZ6 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| GMA Immunohistochemistry | |||
| Diamond tipped pen | Histolab | 5218 | |
| Hydrogen peroxide 30% solution | AnalaR Normapur | 23619.264 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Tris | Roche | 10708976001 | |
| Sodium chloride | VWR chemicals | 27810.295 | |
| Bovine serum albumin | Millipore | 82-045-2 | Probumin BSA diagnostic grade |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| Anti-human CD45 antibody | BioLegend | 304002 | Mouse monoclonal, clone HI30, isotype IgG1k. Working concentration of 500 ng/ml |
| Anti-human CD1a antibody | AbD Serotech | MCA80GA | Mouse monoclonal, clone NA1/34-HLK, isotype IgG2a. Working concentration of 10 µg/ml |
| Mouse monoclonal IgG1 isotype control | Abcam | ab27479 | |
| Mouse monoclonal IgG2a isotype control | Dako | X094301-2 | |
| Vectastain ABC Elite standard kit | Vector Labs | PK-6100 | |
| AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) peroxidase substrate kite | Vector Labs | SK-4200 | |
| Mayers haematoxylin | HistoLab | 01820 | |
| Permanent Aqueous Mounting Medium | AbD Serotech | BUF058C | |
| Drying oven | |||
| DPX permanent mounting solution | VWR | 360292F | |
| Light microscope | Leica | Leica DMLB | |
| Microscope camera | Leica | Leica DFC 320 | |
| Analysis software | Leica | Leica Qwin V3 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Enzymatic digestion | |||
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | 55021C | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| Collagenase II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | 10104159001 ROCHE | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Forceps | |||
| Platform rocker | Grant instruments | PMR-30 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 14-432-22 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Flow cytometry | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| LIVE/DEAD Aqua fixable dead cell stain kit | Life Technologies | L34957 | |
| CD45 | BD | 555485 | |
| CD3 | BD | 557757 | |
| CD20 | BD | 335829 | |
| CD56 | Biolegend | 318332 | |
| CD66abce | Miltenyi | 130-101-132 | |
| HLA-DR | BD | 555813 | |
| CD14 | BD | 557831 | |
| CD16 | Biolegend | 302026 | |
| CD11c | BD | 560369 | |
| CD1c | Miltenyi | 130-098-009 | |
| CD141 | Miltenyi | 130-090-514 | |
| CD103 | Biolegend | 350212 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| LSR II Flow cytometer | BD | Flow cytometer | |
| FlowJo | FlowJo | Software for analysis |
References
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