Человеческие клетки легких Дендритные: Пространственное распределение и фенотипической идентификации в Эндобронхиальная Биопсию Использование иммуногистохимии и проточной цитометрии
Summary
Lung-resident immune cells, including dendritic cells (DCs) in humans, are critical for defense against inhaled pathogens and allergens. However, due to the scarcity of human lung tissue, studies are limited. This work presents protocols to process human mucosal endobronchial biopsies for studying lung DCs using immunohistochemistry and flow cytometry.
Abstract
The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In order to maintain tolerance or to induce an immune response, the immune system must appropriately handle inhaled antigens. Lung dendritic cells (DCs) are essential in maintaining a delicate balance to initiate immunity when required without causing collateral damage to the lungs due to an exaggerated inflammatory response. While there is a detailed understanding of the phenotype and function of immune cells such as DCs in human blood, the knowledge of these cells in less accessible tissues, such as the lungs, is much more limited, since studies of human lung tissue samples, especially from healthy individuals, are scarce. This work presents a strategy to generate detailed spatial and phenotypic characterization of lung tissue resident DCs in healthy humans that undergo a bronchoscopy for the sampling of endobronchial biopsies. Several small biopsies can be collected from each individual and can be subsequently embedded for ultrafine sectioning or enzymatically digested for advanced flow cytometric analysis. The outlined protocols have been optimized to yield maximum information from small tissue samples that, under steady-state conditions, contain only a low frequency of DCs. While the present work focuses on DCs, the methods described can directly be expanded to include other (immune) cells of interest found in mucosal lung tissue. Furthermore, the protocols are also directly applicable to samples obtained from patients suffering from pulmonary diseases where bronchoscopy is part of establishing the diagnosis, such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD), sarcoidosis, or lung cancer.
Introduction
Легкие находятся в постоянном контакте с внешней средой, и высоко подвергают воздействию как безвредные частиц и микробов со способностью вызывать заболевания. Поэтому крайне важно для иммунной системы, чтобы смонтировать сильные иммунные ответы против вторгшихся патогенов, но в равной степени важно для поддержания толерантности к вдыхаемых антигенов, которые не вызывают заболевания. Для обеспечения мощного иммунного надзора, дыхательной системы выстлана сети иммунных клеток, в том числе дендритные клетки (ДК). Контроллеры домена являются профессиональными антиген-представляющими клетками с уникальной способностью активировать наивные Т-клетки. В легких человека, РС – резиденты сталкиваются с антигеном , а затем обработать и транспортировать его в легких осушение лимфатических узлов для представления и активации Т – клеток , 1, 2, 3.
В иммунной системе человека, РС можно разделить на несколько подмножеств, с DistinКТ , но пересекающиеся функции: CD1c + и CD141 + миелоидных ДК (Главгосслужбы) и CD123 + плазмоцитов контроллеры домена (PDCs) 4, 5. В то время как самые подробные знания о человеческом ГЦ проистекает из исследований в крови, теперь очевидно , что человеческие легкие также питают редкие популяции DC подмножеств с Т-клеточным стимулирующим емкостью 6, 7, 8, 9. Тем не менее, аккумулирующие данные показывают , что иммунные клетки, в том числе контроллеры домена, различаются по частоте, фенотип, и функции в зависимости от их анатомического расположения 10. Таким образом, важно, чтобы изучить иммунные клетки из соответствующей ткани, чтобы понять их вклад в местный иммунитет и толерантности. Взятые вместе, это подчеркивает необходимость изучения легких резидентные РС при решении заболеваний легких, несмотря на контроллеры домена крови быть более доступными и доступными в людях.
Первые работы, изучающие легочные резидентные РС в организме человека в основном полагались на морфологии и экспрессии отдельных маркеров, таких как HLA-DR и CD11c, в срезах ткани с помощью иммуногистохимии 11, 12, 13. В противоположность этому, более поздние исследования, как правило, полагаются на проточной цитометрии анализа для изучения различных подмножеств иммунных клеток. Однако, так как трудно найти хотя бы одну клеточной поверхности маркер, который однозначно идентифицирует определенное подмножество постоянного тока, потенциальное ограничение исследований применения только четыре цвета проточной цитометрии является риск в том числе клеточных популяций с аналогичными фенотипических маркеров в качестве контроллеров домена. Например, CD11c экспрессируется на всех миелоидных ДК и подавляющее большинство моноцитов. С другой стороны, в исследованиях применения более совершенных проточная цитометрия панелей, незлокачественный легочной ткани от хирургических резекций пациентов, как правило, используютсяXref "> 10, 14, 15, 16, хотя остается неясным , являются ли эти редкие популяции действительно представительными ДКБ , присутствующих в здоровых субъектов. В целом, исследования ограничены во многом связано с тем , что хирургическим путем удаляется или вся ткань легких человека не хватает.
Для того, чтобы преодолеть некоторые из этих ограничений, эта работа описывает, как выполнить детальный анализ пространственного распределения и фенотипической идентификации контроллеров домена в слизистой оболочке эндобронхиальные биопсий, полученных у здоровых добровольцев, которые подвергаются бронхоскопию. Несколько небольших биопсий могут быть получены от каждого отдельного человека и впоследствии могут быть внедрены для секционирования и анализ с помощью иммуногистохимии или ферментативно переваривается для расширенного анализа проточной цитометрии. Использование легочной ткани в виде эндобронхиальные биопсий из bronchoscopies дает то преимущество, что позволило выполнить стУды на здоровых добровольцах, в отличие от открытой хирургии легких, что, по понятным причинам, ограничивается пациентами, которые требуют торакальной хирургии. Кроме того, ткань, которая оцифровывается во время бронхоскопии от здоровых добровольцев является физиологически нормальным, в отличие от не-пораженный участок легочной ткани у пациентов с легочным заболеванием. С другой стороны, биопсий невелики, и количество клеток, извлекаемых, даже при объединении нескольких биопсий, ограничивает тип анализов, которые могут быть выполнены.
Хотя настоящая работа сосредоточена на контроллерах, описанные способы могут быть непосредственно расширен за счет включения других (иммунные) клетки, представляющие интерес, которые находятся в тканях человека через слизистую оболочку легких. Кроме того, протоколы также непосредственно применимы к образцам, полученным от пациентов, страдающих легочными заболеваниями, где бронхоскопии является частью установления диагноза, таких как хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), саркоидоз, или рак легких.
Protocol
Representative Results
Discussion
В данной статье описывается, как создавать подробные пространственные и фенотипическую характеристику легочных тканей РС-резидентов у здоровых людей с помощью иммуногистохимии и проточной цитометрии на эндобронхиальные слизистых оболочек биопсий, собранных во время бронхоскопии. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить волонтеров, которые внесли свой вклад клинический материал для исследования. Мы также признательны сотрудникам кафедры общественного здравоохранения и клинической медицины, Отдел медицины / респираторной медицины, университетской больницы, Умео (Norrlands universitetssjukhus) для сбора всех клинического материала.
Эта работа была выполнена при поддержке грантов для AS-S от Шведского исследовательского совета, шведского фонда Heart-Lung, Фонд шведского стратегических исследований и Каролинского института.
Materials
| Bronchoscopy | |||
| Bronchoscope BF1T160 | Olympus | BF1T160 | |
| Light source | Olympus | Exera CV-160 | |
| Fenestrated forceps | Olympus | FB21C | Used to take biopsies |
| Bite Block | Conmed | 1429 | 20x27mm |
| Glucose 25% | 500mL intravenous | ||
| Glycopyrronium bromide 0.2mg/mL | Intravenous. Prevents mucus/saliva secretion | ||
| Mixt. Midazolam 1mg/mL p.o | Can be used for extra relaxation | ||
| Lidocaine, 40mg/mL | Mouth and throat administration / Gargled | ||
| Lidocaine 100mg/ml spray | Administered to back of throat | ||
| Lidocaine 20mg/ml spray | Administered via bronchoscope to airways | ||
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| GMA processing and embedding | |||
| Glass vials | 5mL | ||
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201-1L | |
| Molecular sieves, 4A | Alfa Aesar | 88120 | 3-4mm diameter pellets |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P-7626 | 0.035g/100ml acetone |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I-6125 | 0.37g/100ml acetone |
| Polythene-flat TAAB embedding capsules | TAAB laboratories | C094 | x500 8mm diameter, polythene, flat-bottom capsules |
| Capsule holder | TAAB laboratories | C054 | Holds 25 8mm capsules |
| JB-4 GMA embedding kit | Polysciences | 00226 | Contains JB-4 Solution A (0026A-800), JB-4 solution B (0026B-3.8), benzoyl peroxide (02618-12) |
| Methyl benzoate | Sigma-Aldrich | 27614-1L | |
| Silica gel with humidity indicator | Scharlau | GE0043 | 2.5-6mm |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| GMA sectioning | |||
| Glass microscope slides | ThermoFisher Scientific | 10143562CEF | Cut edges, frosted end |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920-500mL | 1:10 for working solution |
| Sheet glass strips for ultramicrotomy | Alkar | ||
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | Wash solution (0.1% Tween20) |
| LKB 7800B Knifemaker | LKB | ||
| Capsule splitter | TAAB laboratories | C065 | |
| Carbon steel single edge blades | TAAB laboratories | B054 | |
| Vice | |||
| Ammonia, 25% | VWR | 1133.1000 | 2mL in 1L, 1:500 (0.05%) |
| Microtome | Leica | Leica RM 2165 | |
| Light source | Leica | Leica CLS 150 XE | |
| Microscope with swing arm stand | Leica | Leica MZ6 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| GMA Immunohistochemistry | |||
| Diamond tipped pen | Histolab | 5218 | |
| Hydrogen peroxide 30% solution | AnalaR Normapur | 23619.264 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Tris | Roche | 10708976001 | |
| Sodium chloride | VWR chemicals | 27810.295 | |
| Bovine serum albumin | Millipore | 82-045-2 | Probumin BSA diagnostic grade |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| Anti-human CD45 antibody | BioLegend | 304002 | Mouse monoclonal, clone HI30, isotype IgG1k. Working concentration of 500 ng/ml |
| Anti-human CD1a antibody | AbD Serotech | MCA80GA | Mouse monoclonal, clone NA1/34-HLK, isotype IgG2a. Working concentration of 10 µg/ml |
| Mouse monoclonal IgG1 isotype control | Abcam | ab27479 | |
| Mouse monoclonal IgG2a isotype control | Dako | X094301-2 | |
| Vectastain ABC Elite standard kit | Vector Labs | PK-6100 | |
| AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) peroxidase substrate kite | Vector Labs | SK-4200 | |
| Mayers haematoxylin | HistoLab | 01820 | |
| Permanent Aqueous Mounting Medium | AbD Serotech | BUF058C | |
| Drying oven | |||
| DPX permanent mounting solution | VWR | 360292F | |
| Light microscope | Leica | Leica DMLB | |
| Microscope camera | Leica | Leica DFC 320 | |
| Analysis software | Leica | Leica Qwin V3 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Enzymatic digestion | |||
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | 55021C | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| Collagenase II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | 10104159001 ROCHE | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Forceps | |||
| Platform rocker | Grant instruments | PMR-30 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 14-432-22 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Flow cytometry | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| LIVE/DEAD Aqua fixable dead cell stain kit | Life Technologies | L34957 | |
| CD45 | BD | 555485 | |
| CD3 | BD | 557757 | |
| CD20 | BD | 335829 | |
| CD56 | Biolegend | 318332 | |
| CD66abce | Miltenyi | 130-101-132 | |
| HLA-DR | BD | 555813 | |
| CD14 | BD | 557831 | |
| CD16 | Biolegend | 302026 | |
| CD11c | BD | 560369 | |
| CD1c | Miltenyi | 130-098-009 | |
| CD141 | Miltenyi | 130-090-514 | |
| CD103 | Biolegend | 350212 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| LSR II Flow cytometer | BD | Flow cytometer | |
| FlowJo | FlowJo | Software for analysis |
References
- Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).
- Condon, T. V., Sawyer, R. T., Fenton, M. J., Riches, D. W. Lung dendritic cells at the innate-adaptive immune interface. J Leukoc Biol. 90 (5), 883-895 (2011).
- Lambrecht, B. N., Hammad, H. Biology of lung dendritic cells at the origin of asthma. Immunity. 31 (3), 412-424 (2009).
- Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems. Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).
- Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116 (16), e74-e80 (2010).
- Demedts, I. K., Brusselle, G. G., Vermaelen, K. Y., Pauwels, R. A. Identification and characterization of human pulmonary dendritic cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 32 (3), 177-184 (2005).
- Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D. Identification rare-event detection and analysis of dendritic cell subsets in broncho-alveolar lavage fluid and peripheral blood by flow cytometry. Front Biosci. 8, s1175-s1180 (2003).
- Masten, B. J., et al. Characterization of myeloid and plasmacytoid dendritic cells in human lung. J Immunol. 177 (11), 7784-7793 (2006).
- Ten Berge, B., et al. A novel method for isolating dendritic cells from human bronchoalveolar lavage fluid. J Immunol Methods. 351 (1-2), 13-23 (2009).
- Yu, C. I., et al. Human CD1c+ dendritic cells drive the differentiation of CD103+ CD8+ mucosal effector T cells via the cytokine TGF-beta. Immunity. 38 (4), 818-830 (2013).
- Nicod, L. P., Lipscomb, M. F., Toews, G. B., Weissler, J. C. Separation of potent and poorly functional human lung accessory cells based on autofluorescence. J Leukoc Biol. 45 (5), 458-465 (1989).
- Sertl, K., et al. Dendritic cells with antigen-presenting capability reside in airway epithelium, lung parenchyma, and visceral pleura. J Exp Med. 163 (2), 436-451 (1986).
- van Haarst, J. M., de Wit, H. J., Drexhage, H. A., Hoogsteden, H. C. Distribution and immunophenotype of mononuclear phagocytes and dendritic cells in the human lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 10 (5), 487-492 (1994).
- Schlitzer, A., et al. IRF4 transcription factor-dependent CD11b+ dendritic cells in human and mouse control mucosal IL-17 cytokine responses. Immunity. 38 (5), 970-983 (2013).
- Yu, Y. A., et al. Flow Cytometric Analysis of Myeloid Cells in Human Blood, Bronchoalveolar Lavage, and Lung Tissues. Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).
- Haniffa, M., et al. Human tissues contain CD141hi cross-presenting dendritic cells with functional homology to mouse CD103+ nonlymphoid dendritic cells. Immunity. 37 (1), 60-73 (2012).
- Britten, K. M., Howarth, P. H., Roche, W. R. Immunohistochemistry on resin sections: a comparison of resin embedding techniques for small mucosal biopsies. Biotech Histochem. 68 (5), 271-280 (1993).
- Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).
- Baharom, F., et al. Dendritic Cells and Monocytes with Distinct Inflammatory Responses Reside in Lung Mucosa of Healthy Humans. J Immunol. 196 (11), 4498-4509 (2016).
- Salvi, S., et al. Acute inflammatory responses in the airways and peripheral blood after short-term exposure to diesel exhaust in healthy human volunteers. Am J Respir Crit Care Med. 159 (3), 702-709 (1999).
- Schon-Hegrad, M. A., Oliver, J., McMenamin, P. G., Holt, P. G. Studies on the density, distribution, and surface phenotype of intraepithelial class II major histocompatibility complex antigen (Ia)-bearing dendritic cells (DC) in the conducting airways. J Exp Med. 173 (6), 1345-1356 (1991).
- Saeys, Y., Gassen, S. V., Lambrecht, B. N. Computational flow cytometry: helping to make sense of high-dimensional immunology data. Nat Rev Immunol. 16 (7), 449-462 (2016).
