Human Cells Lung dendritiques: Répartition spatiale et phénotypique identification dans endobronchique Biopsies par immunohistochimie et cytométrie de flux
Summary
Lung-resident immune cells, including dendritic cells (DCs) in humans, are critical for defense against inhaled pathogens and allergens. However, due to the scarcity of human lung tissue, studies are limited. This work presents protocols to process human mucosal endobronchial biopsies for studying lung DCs using immunohistochemistry and flow cytometry.
Abstract
The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In order to maintain tolerance or to induce an immune response, the immune system must appropriately handle inhaled antigens. Lung dendritic cells (DCs) are essential in maintaining a delicate balance to initiate immunity when required without causing collateral damage to the lungs due to an exaggerated inflammatory response. While there is a detailed understanding of the phenotype and function of immune cells such as DCs in human blood, the knowledge of these cells in less accessible tissues, such as the lungs, is much more limited, since studies of human lung tissue samples, especially from healthy individuals, are scarce. This work presents a strategy to generate detailed spatial and phenotypic characterization of lung tissue resident DCs in healthy humans that undergo a bronchoscopy for the sampling of endobronchial biopsies. Several small biopsies can be collected from each individual and can be subsequently embedded for ultrafine sectioning or enzymatically digested for advanced flow cytometric analysis. The outlined protocols have been optimized to yield maximum information from small tissue samples that, under steady-state conditions, contain only a low frequency of DCs. While the present work focuses on DCs, the methods described can directly be expanded to include other (immune) cells of interest found in mucosal lung tissue. Furthermore, the protocols are also directly applicable to samples obtained from patients suffering from pulmonary diseases where bronchoscopy is part of establishing the diagnosis, such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD), sarcoidosis, or lung cancer.
Introduction
Les poumons sont en contact permanent avec l'environnement extérieur et sont très exposés à la fois des particules et des microbes inoffensifs ayant la capacité de provoquer une maladie. Par conséquent, il est essentiel pour le système immunitaire pour monter des réponses immunitaires puissantes contre les pathogènes envahissants, mais il est tout aussi important de maintenir la tolérance aux antigènes inhalés qui ne provoquent pas de maladie. Pour assurer la surveillance immunitaire puissante, le système respiratoire est garni d'un réseau de cellules du système immunitaire, notamment des cellules dendritiques (CD). DC sont des cellules présentatrices d'antigène professionnelles avec la capacité unique d'activer les cellules T naïves. Dans les poumons humains, les DC résidents rencontrent un antigène et ensuite traiter et de le transporter vers les ganglions lymphatiques drainant des poumons pour la présentation et à l' activation des cellules T 1, 2, 3.
Dans le système immunitaire humain, les DC peuvent être divisés en plusieurs sous-ensembles, avec distinct , mais qui se chevauchent fonctions: CD1c + et CD141 + DC myéloïdes (MDC) et CD123 + DC plasmacytoïdes (PDC) 4, 5. Alors que la plupart des connaissances détaillées sur les DC humaine provient des études dans le sang, il est maintenant évident que les poumons humains abritent aussi des populations rares de sous – ensembles DC avec des cellules T capacité stimulatrice 6, 7, 8, 9. Cependant, les données montrent que l' accumulation des cellules immunitaires, y compris les DC, diffèrent par leur fréquence, leur phénotype et la fonction en fonction de leur emplacement anatomique 10. Ainsi, il est important d'étudier les cellules du système immunitaire du tissu pertinent pour comprendre leur contribution à l'immunité locale et la tolérance. Pris ensemble, ce qui souligne la nécessité d'étudier les PED pulmonaires résident lorsque lutter contre les maladies pulmonaires, malgré les PED sanguins étant plus facilement disponibles et accessibles chez l'homme.
Les premières études qui a enquêté sur les PED pulmonaires résident chez l' homme sont principalement fondés sur la morphologie et l'expression de marqueurs simples, tels que HLA-DR et CD11c, dans des coupes de tissus par immunohistochimie 11, 12, 13. En revanche, des études plus récentes ont généralement compté sur cytométrie de flux des analyses pour étudier les différents sous-ensembles de cellules immunitaires. Cependant, étant donné qu'il est difficile de trouver un seul marqueur de surface cellulaire qui identifie uniquement un sous-ensemble spécifique DC, la limitation potentielle des études qu'appliquer quatre couleurs cytométrie en flux est le risque d'inclure des populations de cellules avec des marqueurs phénotypiques semblables à DC. Par exemple, CD11c est exprimée sur tous les DC myéloïdes et la grande majorité des monocytes. D'autre part, dans les études appliquant plus avancées panneaux de cytométrie de flux, les tissus pulmonaires non cancéreuses de résections chirurgicales de patients ont été généralement utiliséxref "> 10, 14, 15, 16, même si on ne sait pas si ces populations rares sont vraiment représentatives des PED présents chez des sujets sains. Dans l' ensemble, les études sont limitées en grande partie due au fait que chirurgicalement enlevé ou tissu entier de poumon humain est rare.
Pour surmonter certaines de ces limitations, cet ouvrage décrit comment effectuer une analyse détaillée de la distribution spatiale et une identification phénotypique des CD dans les biopsies bronchiques muqueuses obtenues chez des volontaires sains qui subissent une bronchoscopie. Plusieurs petites biopsies peuvent être collectées à partir de chaque individu et peuvent ensuite être intégrées pour sectionner et de l'analyse par immunohistochimie ou enzymatiquement digéré pour l'analyse avancée par cytométrie de flux. En utilisant le tissu pulmonaire sous forme de biopsies bronchiques obtenues à partir de bronchoscopies confère l'avantage de rendre possible la réalisation de la study sur des volontaires sains, contrairement à la chirurgie ouverte des poumons qui, pour des raisons évidentes, est limitée aux patients qui nécessitent une chirurgie thoracique. En outre, le tissu qui est échantillonné au cours d'une bronchoscopie chez des volontaires sains est physiologiquement normal, contrairement à une zone non affectée du tissu pulmonaire chez les patients présentant une maladie pulmonaire. D'autre part, les biopsies sont faibles et le nombre de cellules récupérées, même lorsque la mise en commun de plusieurs biopsies, limite le type d'analyses qui peuvent être effectuées.
Bien que le présent travail se concentre sur les pays en développement, les méthodes décrites peuvent être directement élargi pour inclure d'autres cellules (immunitaires) d'intérêt qui résident dans le tissu muqueux de poumon humain. En outre, les protocoles sont également directement applicable à des échantillons prélevés sur des patients souffrant de maladies pulmonaires où la bronchoscopie fait partie de l'établissement du diagnostic, telles que la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC), la sarcoïdose, ou d'un cancer du poumon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article décrit comment générer une caractérisation spatiale et phénotypique détaillée du poumon PED tissus résidents chez l'homme sain par immunohistochimie et cytométrie en flux sur des biopsies muqueuses bronchiques recueillies au cours de la bronchoscopie. Dans les paragraphes qui suivent les étapes critiques dans le protocole sont discutés en détail.
Étapes critiques avec le Protocole
Sectionner et immunohistochimie: Il est essentiel de gard…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier les bénévoles qui ont contribué matériel clinique à cette étude. Nous sommes également reconnaissants envers le personnel du ministère de la Santé publique et de la médecine clinique, Division de la médecine / médecine respiratoire, Hôpital universitaire, Umeå (Norrlands universitetssjukhus) pour la collecte de tout le matériel clinique.
Ce travail a été soutenu par des subventions à l'AS-S du Conseil suédois de la recherche, la Fondation suédoise Heart-Lung, la Fondation suédoise pour la recherche stratégique et le Karolinska Institutet.
Materials
| Bronchoscopy | |||
| Bronchoscope BF1T160 | Olympus | BF1T160 | |
| Light source | Olympus | Exera CV-160 | |
| Fenestrated forceps | Olympus | FB21C | Used to take biopsies |
| Bite Block | Conmed | 1429 | 20x27mm |
| Glucose 25% | 500mL intravenous | ||
| Glycopyrronium bromide 0.2mg/mL | Intravenous. Prevents mucus/saliva secretion | ||
| Mixt. Midazolam 1mg/mL p.o | Can be used for extra relaxation | ||
| Lidocaine, 40mg/mL | Mouth and throat administration / Gargled | ||
| Lidocaine 100mg/ml spray | Administered to back of throat | ||
| Lidocaine 20mg/ml spray | Administered via bronchoscope to airways | ||
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| GMA processing and embedding | |||
| Glass vials | 5mL | ||
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201-1L | |
| Molecular sieves, 4A | Alfa Aesar | 88120 | 3-4mm diameter pellets |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P-7626 | 0.035g/100ml acetone |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I-6125 | 0.37g/100ml acetone |
| Polythene-flat TAAB embedding capsules | TAAB laboratories | C094 | x500 8mm diameter, polythene, flat-bottom capsules |
| Capsule holder | TAAB laboratories | C054 | Holds 25 8mm capsules |
| JB-4 GMA embedding kit | Polysciences | 00226 | Contains JB-4 Solution A (0026A-800), JB-4 solution B (0026B-3.8), benzoyl peroxide (02618-12) |
| Methyl benzoate | Sigma-Aldrich | 27614-1L | |
| Silica gel with humidity indicator | Scharlau | GE0043 | 2.5-6mm |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| GMA sectioning | |||
| Glass microscope slides | ThermoFisher Scientific | 10143562CEF | Cut edges, frosted end |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920-500mL | 1:10 for working solution |
| Sheet glass strips for ultramicrotomy | Alkar | ||
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | Wash solution (0.1% Tween20) |
| LKB 7800B Knifemaker | LKB | ||
| Capsule splitter | TAAB laboratories | C065 | |
| Carbon steel single edge blades | TAAB laboratories | B054 | |
| Vice | |||
| Ammonia, 25% | VWR | 1133.1000 | 2mL in 1L, 1:500 (0.05%) |
| Microtome | Leica | Leica RM 2165 | |
| Light source | Leica | Leica CLS 150 XE | |
| Microscope with swing arm stand | Leica | Leica MZ6 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| GMA Immunohistochemistry | |||
| Diamond tipped pen | Histolab | 5218 | |
| Hydrogen peroxide 30% solution | AnalaR Normapur | 23619.264 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Tris | Roche | 10708976001 | |
| Sodium chloride | VWR chemicals | 27810.295 | |
| Bovine serum albumin | Millipore | 82-045-2 | Probumin BSA diagnostic grade |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| Anti-human CD45 antibody | BioLegend | 304002 | Mouse monoclonal, clone HI30, isotype IgG1k. Working concentration of 500 ng/ml |
| Anti-human CD1a antibody | AbD Serotech | MCA80GA | Mouse monoclonal, clone NA1/34-HLK, isotype IgG2a. Working concentration of 10 µg/ml |
| Mouse monoclonal IgG1 isotype control | Abcam | ab27479 | |
| Mouse monoclonal IgG2a isotype control | Dako | X094301-2 | |
| Vectastain ABC Elite standard kit | Vector Labs | PK-6100 | |
| AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) peroxidase substrate kite | Vector Labs | SK-4200 | |
| Mayers haematoxylin | HistoLab | 01820 | |
| Permanent Aqueous Mounting Medium | AbD Serotech | BUF058C | |
| Drying oven | |||
| DPX permanent mounting solution | VWR | 360292F | |
| Light microscope | Leica | Leica DMLB | |
| Microscope camera | Leica | Leica DFC 320 | |
| Analysis software | Leica | Leica Qwin V3 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Enzymatic digestion | |||
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | 55021C | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| Collagenase II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | 10104159001 ROCHE | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Forceps | |||
| Platform rocker | Grant instruments | PMR-30 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 14-432-22 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Flow cytometry | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| LIVE/DEAD Aqua fixable dead cell stain kit | Life Technologies | L34957 | |
| CD45 | BD | 555485 | |
| CD3 | BD | 557757 | |
| CD20 | BD | 335829 | |
| CD56 | Biolegend | 318332 | |
| CD66abce | Miltenyi | 130-101-132 | |
| HLA-DR | BD | 555813 | |
| CD14 | BD | 557831 | |
| CD16 | Biolegend | 302026 | |
| CD11c | BD | 560369 | |
| CD1c | Miltenyi | 130-098-009 | |
| CD141 | Miltenyi | 130-090-514 | |
| CD103 | Biolegend | 350212 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| LSR II Flow cytometer | BD | Flow cytometer | |
| FlowJo | FlowJo | Software for analysis |
References
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