免疫組織化学およびフローサイトメトリーを用いた気管支生検における空間分布と表現型の同定：ヒト肺樹状細胞
Summary
Lung-resident immune cells, including dendritic cells (DCs) in humans, are critical for defense against inhaled pathogens and allergens. However, due to the scarcity of human lung tissue, studies are limited. This work presents protocols to process human mucosal endobronchial biopsies for studying lung DCs using immunohistochemistry and flow cytometry.
Abstract
The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In order to maintain tolerance or to induce an immune response, the immune system must appropriately handle inhaled antigens. Lung dendritic cells (DCs) are essential in maintaining a delicate balance to initiate immunity when required without causing collateral damage to the lungs due to an exaggerated inflammatory response. While there is a detailed understanding of the phenotype and function of immune cells such as DCs in human blood, the knowledge of these cells in less accessible tissues, such as the lungs, is much more limited, since studies of human lung tissue samples, especially from healthy individuals, are scarce. This work presents a strategy to generate detailed spatial and phenotypic characterization of lung tissue resident DCs in healthy humans that undergo a bronchoscopy for the sampling of endobronchial biopsies. Several small biopsies can be collected from each individual and can be subsequently embedded for ultrafine sectioning or enzymatically digested for advanced flow cytometric analysis. The outlined protocols have been optimized to yield maximum information from small tissue samples that, under steady-state conditions, contain only a low frequency of DCs. While the present work focuses on DCs, the methods described can directly be expanded to include other (immune) cells of interest found in mucosal lung tissue. Furthermore, the protocols are also directly applicable to samples obtained from patients suffering from pulmonary diseases where bronchoscopy is part of establishing the diagnosis, such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD), sarcoidosis, or lung cancer.
Introduction
肺は、外部環境と連続的に接触している、高度に疾患を引き起こす能力を有する無害な粒子および微生物の両方にさらされています。したがって、侵入する病原体に対する強力な免疫応答をマウントする免疫システムにとって重要であるが、病気を引き起こさない吸入抗原に対する寛容を維持することも同様に重要です。強力な免疫監視機構を提供するために、呼吸器系は、樹状細胞（DC）を含む免疫細胞のネットワークが並んでいます。 DCは、ナイーブT細胞を活性化する固有の能力を有するプロフェッショナル抗原提示細胞です。ヒトの肺において、常駐DCを抗原と、処理が発生し、T細胞を1、2、3に提示および活性化のために肺流入領域リンパ節に輸送します。
ヒト免疫系では、DCはdistinで、複数のサブセットに分割することができCTが、重複する機能：CD1c +およびCD141 +骨髄性樹状細胞（MDCの）とCD123 +形質樹状細胞（PDCに）4、5。ヒトDC上で最も詳細な知識は、血液中の研究に由来するが、人間の肺はまた、T細胞刺激能6、7、8、9でDCサブセットの希少集団を保有することは現在明らかです。しかし、蓄積したデータは、DCなどの免疫細胞は、その解剖学的位置10に応じてその頻度、表現型、および機能が異なることを示しています。したがって、局所免疫と寛容への貢献を理解するために、関連する組織から免疫細胞を研究することが重要です。まとめると、これは、血液DCは、より容易に入手可能であり、アクセス可能であるにもかかわらず、肺疾患に対処するとき、肺常駐DCを検討する必要性を強調します人間インチ
ヒトにおける肺常駐DCを調べた最初の研究は、主に免疫組織化学11、12、13を用いて組織切片において、形態や、HLA-DRおよびCD11cのような単一のマーカーの発現に依存していました。対照的に、典型的には、フローサイトメトリーに依存していたより最近の研究は、異なる免疫細胞サブセットを研究するために分析します。それは一意に特定のDCサブセットを識別する単一細胞表面マーカーを見出すことは困難であるので、わずか4色フローサイトメトリーを適用した研究の潜在的な制限は、DCと同様の表現型マーカーを有する細胞集団を含む、危険です。例えば、CD11cのすべての骨髄性DCおよび単球の大半で発現されます。一方、より高度なフローサイトメトリーパネルを適用する研究において、患者の外科的切除からの非癌性肺組織は、典型的に使用されました外部参照"> 10、14、15、16、これらの稀な集団が真に健康な被験者でのDCの存在の代表的なものであるかどうかは不明ですが。全体的には、研究は主として外科的に除去または全ヒト肺組織が不足しているという事実に制限されています。
これらの制限のいくつかを克服するために、この作品は空間分布と気管支鏡検査を受ける健康なボランティアから得た粘膜気管支生検におけるDCの表現型の識別の詳細な分析を実行する方法について説明します。いくつかの小さな生検を、各個体から採取することができ、その後、免疫組織化学を使用して切片化し、分析のために埋め込まれた、または酵素的に高度なフローサイトメトリー分析のために消化することができます。 bronchoscopiesから得られた気管支生検の形で肺組織を使用して、STを実行することを可能にするという利点を与えますUDYは、健康なボランティアに、肺の開放手術とは異なり、明らかな理由のために、胸部外科手術を必要とする患者に限定されている、ということ。さらに、健康なボランティアの気管支鏡検査の間にサンプリングされた組織は、肺疾患を有する患者における肺組織の非患部とは対照的に、生理的に正常です。一方、生検が小さく、いくつかの生検をプールさえ取得細胞の数は、実行することができる分析のタイプを制限します。
本研究は、樹状細胞に焦点を当てているが、記載された方法は、直接人間の粘膜肺組織に存在する関心のある他の（免疫）細胞を含むように拡張することができます。さらに、プロトコルはまた、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、サルコイドーシス、または肺癌のような気管支鏡検査は、診断を確立するための部分である肺疾患、に罹患した患者から得られた試料に直接適用可能です。
Protocol
Representative Results
Discussion
本稿では、免疫組織化学を使用して、健康なヒトにおける肺組織常駐DCの詳細な空間と表現型の特徴付けを生成し、気管支鏡検査中に収集された気管支粘膜生検でフローサイトメトリーする方法について説明します。以下の段落では、プロトコルにおける重要なステップは、詳細に説明します。
議定書の重要なステップ
セクショニングおよび免疫組織?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、この研究に臨床材料を貢献したボランティアに感謝したいと思います。我々はまた、すべての臨床材料の収集のための公衆衛生・臨床医学/呼吸器内科の部門、大学病院、ウメオ（Norrlandsのuniversitetssjukhus）の部門のスタッフに感謝しています。
この作品は、スウェーデンの研究評議会、スウェーデン心肺財団、戦略研究のためのスウェーデンの財団、カロリンスカ研究所からAS-Sへの助成金によってサポートされていました。
Materials
| Bronchoscopy | |||
| Bronchoscope BF1T160 | Olympus | BF1T160 | |
| Light source | Olympus | Exera CV-160 | |
| Fenestrated forceps | Olympus | FB21C | Used to take biopsies |
| Bite Block | Conmed | 1429 | 20x27mm |
| Glucose 25% | 500mL intravenous | ||
| Glycopyrronium bromide 0.2mg/mL | Intravenous. Prevents mucus/saliva secretion | ||
| Mixt. Midazolam 1mg/mL p.o | Can be used for extra relaxation | ||
| Lidocaine, 40mg/mL | Mouth and throat administration / Gargled | ||
| Lidocaine 100mg/ml spray | Administered to back of throat | ||
| Lidocaine 20mg/ml spray | Administered via bronchoscope to airways | ||
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| GMA processing and embedding | |||
| Glass vials | 5mL | ||
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201-1L | |
| Molecular sieves, 4A | Alfa Aesar | 88120 | 3-4mm diameter pellets |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P-7626 | 0.035g/100ml acetone |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I-6125 | 0.37g/100ml acetone |
| Polythene-flat TAAB embedding capsules | TAAB laboratories | C094 | x500 8mm diameter, polythene, flat-bottom capsules |
| Capsule holder | TAAB laboratories | C054 | Holds 25 8mm capsules |
| JB-4 GMA embedding kit | Polysciences | 00226 | Contains JB-4 Solution A (0026A-800), JB-4 solution B (0026B-3.8), benzoyl peroxide (02618-12) |
| Methyl benzoate | Sigma-Aldrich | 27614-1L | |
| Silica gel with humidity indicator | Scharlau | GE0043 | 2.5-6mm |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| GMA sectioning | |||
| Glass microscope slides | ThermoFisher Scientific | 10143562CEF | Cut edges, frosted end |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920-500mL | 1:10 for working solution |
| Sheet glass strips for ultramicrotomy | Alkar | ||
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | Wash solution (0.1% Tween20) |
| LKB 7800B Knifemaker | LKB | ||
| Capsule splitter | TAAB laboratories | C065 | |
| Carbon steel single edge blades | TAAB laboratories | B054 | |
| Vice | |||
| Ammonia, 25% | VWR | 1133.1000 | 2mL in 1L, 1:500 (0.05%) |
| Microtome | Leica | Leica RM 2165 | |
| Light source | Leica | Leica CLS 150 XE | |
| Microscope with swing arm stand | Leica | Leica MZ6 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| GMA Immunohistochemistry | |||
| Diamond tipped pen | Histolab | 5218 | |
| Hydrogen peroxide 30% solution | AnalaR Normapur | 23619.264 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Tris | Roche | 10708976001 | |
| Sodium chloride | VWR chemicals | 27810.295 | |
| Bovine serum albumin | Millipore | 82-045-2 | Probumin BSA diagnostic grade |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| Anti-human CD45 antibody | BioLegend | 304002 | Mouse monoclonal, clone HI30, isotype IgG1k. Working concentration of 500 ng/ml |
| Anti-human CD1a antibody | AbD Serotech | MCA80GA | Mouse monoclonal, clone NA1/34-HLK, isotype IgG2a. Working concentration of 10 µg/ml |
| Mouse monoclonal IgG1 isotype control | Abcam | ab27479 | |
| Mouse monoclonal IgG2a isotype control | Dako | X094301-2 | |
| Vectastain ABC Elite standard kit | Vector Labs | PK-6100 | |
| AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) peroxidase substrate kite | Vector Labs | SK-4200 | |
| Mayers haematoxylin | HistoLab | 01820 | |
| Permanent Aqueous Mounting Medium | AbD Serotech | BUF058C | |
| Drying oven | |||
| DPX permanent mounting solution | VWR | 360292F | |
| Light microscope | Leica | Leica DMLB | |
| Microscope camera | Leica | Leica DFC 320 | |
| Analysis software | Leica | Leica Qwin V3 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Enzymatic digestion | |||
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | 55021C | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| Collagenase II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | 10104159001 ROCHE | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Forceps | |||
| Platform rocker | Grant instruments | PMR-30 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 14-432-22 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Flow cytometry | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| LIVE/DEAD Aqua fixable dead cell stain kit | Life Technologies | L34957 | |
| CD45 | BD | 555485 | |
| CD3 | BD | 557757 | |
| CD20 | BD | 335829 | |
| CD56 | Biolegend | 318332 | |
| CD66abce | Miltenyi | 130-101-132 | |
| HLA-DR | BD | 555813 | |
| CD14 | BD | 557831 | |
| CD16 | Biolegend | 302026 | |
| CD11c | BD | 560369 | |
| CD1c | Miltenyi | 130-098-009 | |
| CD141 | Miltenyi | 130-090-514 | |
| CD103 | Biolegend | 350212 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| LSR II Flow cytometer | BD | Flow cytometer | |
| FlowJo | FlowJo | Software for analysis |
References
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