Summary

Seq كاريب ورقاقة Seq: أساليب لتحديد الكشف المرتبطة الكروماتين وتفاعلات البروتين-الحمض النووي في الخلايا الجذعية الجنينية

Published: May 25, 2018
doi:

Summary

هنا، يمكننا وصف أساليب أداء Seq رقاقة وخرائط كاريب-Seq، بما في ذلك إعداد المكتبة لتسلسل الجيل القادم، لتوليد ابيجينوميك العالمية، والجيش الملكي النيبالي المرتبطة الكروماتين في دإط الخلايا.

Abstract

الخلايا الجذعية الجنينية (ES) الذاتي تجديد والتمايز محكوم بإشارات خارجية والشبكات المضمنة المنظمين جينية، عوامل النسخ والترجمة بعد إدخال تعديلات على هيستونيس التي كومبيناتوريالي تؤثر الجينات الدولة تعبير الجينات القريبة. كما تبين أيضا الجيش الملكي النيبالي للتفاعل مع البروتينات المختلفة لتنظيم ديناميات الكروماتين والتعبير الجيني. إيمونوبريسيبيتيشن رنا المرتبطة الكروماتين (كاريب) تليها الجيل التالي التسلسل (كاريب-Seq) طريقة جديدة لمسح الكشف المرتبطة بالبروتينات الكروماتين، بينما الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن تليها (تسلسل الجيل المقبل تشيبسيق) وأسلوب الجينوميات قوية خريطة موقع تعديل بوستترانسلاشونال هيستونيس، وعوامل النسخ والمعدلات جينية على نطاق عالمي في دإط الخلايا. هنا، يمكننا وصف أساليب لأداء Seq كاريب ورقاقة-Seq، بما في ذلك بناء مكتبة لتسلسل الجيل القادم، لتوليد الحمض النووي الريبي العالمية المرتبطة الكروماتين وخرائط ابيجينوميك في خلايا ES.

Introduction

وينظم الاتصال بين إشارات خارج الخلية ومجموعة من النسخي المنظمين، بما في ذلك معدلات هستون، وتعديل الترجمة بعد انتهاء ذيول هيستون قرارات مصير الخلايا الجذعية الجنينية (ES). هذه التفاعلات تيسير الوصول الكروماتين والتعبئة والتغليف من الكروماتين في واحدة من دولتين: يوتشروماتين، ومفتوحة ونشطة ترانسكريبتيونالي، وهيتيروتشروماتين، وصغير وعموما ترانسكريبتيونالي الخاملة. عوامل النسخ مع الانتماءات الملزمة الخاصة بتسلسل الحمض النووي ومعاون المعدلات جينية مع المناطق يوتشروماتيك للمشاركة في التحكم في التعبير الجيني. أساليب تسلسل الجيل القادم، بما فيها رقاقة Seq1، قد ساعدت في رسم خرائط الجينوم على نطاق شبكات النسخي التي أساسية بالنسبة لوفاق الخلية التجديد الذاتي وبلوريبوتينسي2،3،4 ،،من56. وعلاوة على ذلك، بينما إيمونوبريسييشن الحمض النووي الريبي تليها الجيل التالي التسلسل (RIP-Seq)7 تقييمات لتفاعلات البروتين الحمض النووي الريبي تشير إلى أن الحمض النووي ملزم البروتينات تتفاعل مع الكشف لتنظيم أحداث النسخي7، 8 , 9 , 10 , 11 , 12، حققت بضعة دراسات التعريب على نطاق الجينوم للكشف المرتبطة الكروماتين12، أو التفاعلات العالمية بين التعديلات الجيش الملكي النيبالي وهيستون. الكشف منذ فترة طويلة غير الترميز (لنكرناس) هي فئة واحدة من الكشف التي تم العثور عليها لتنظيم نشاط البروتينات المرتبطة الكروماتين13،،من1415. على سبيل المثال، هو زيست لنكرنا الذي ينظم، في خلايا الثدييات الإناث، المنظمة كروموسوم إكس واحد، عن طريق تعيين16،ريبريسورس جينية17. الطيف الكامل من الكشف المرتبطة بلونين غير معروفة إلى حد كبير. هنا، يمكننا وصف بروتوكول رواية، إيمونوبريسيبيتيشن الحمض النووي الريبي المرتبطة الكروماتين (كاريب) تليها الجيل التالي التسلسل (كاريب-Seq)، لتحديد الكشف المرتبطة الكروماتين على نطاق الجينوم في دإط الخلايا، بما في ذلك إعداد المكتبة تسلسل الجيل المقبل، ورقاقة-Seq خريطة شغل عالمي هستون التعديلات وعوامل النسخ والمعدلات جينية. خلافا لسائر أساليب Seq التمزق7، يتضمن كاريب-تسلسل الخطوات crosslinking وسونيكيشن، والتي تسمح للتعرف مباشرة على الكشف المرتبطة بلونين. معا، Seq رقاقة أداة قوية لتحديد تفاعلات البروتين على نطاق الجينوم الحمض النووي، بينما كاريب Seq وسيلة قوية لمسح الكشف المرتبطة بمكونات الكروماتين.

Protocol

1-ثقافة الماوس دإط الخلايا في ظروف خالية من علبة التغذية بالورق. ملاحظة: يتم تقليديا مثقف الماوس دإط الخلايا في وسائط الإعلام على طبق خلية ثقافة مغلفة بالجيلاتين وطبقة أحادية من الماوس الليفية الجنينية (MEF)، التي كانت ميتوتيكالي المعطل (إيميفس). ومع ذلك، يجب إزالة MEFs قبل المصب …

Representative Results

نحن استجوب بنجاح الربط على نطاق الجينوم H3K4me3، و H3K4me2، و KDM5B في دإط الخلايا باستخدام هذا البروتوكول Seq رقاقة6. دإط الخلايا المستزرعة في ظروف خالية من علبة التغذية بالورق (الشكل 1)، وتصميمهما على النحو المبين أعلاه. سونيكيشن فيما بعد إجراء كما هو م…

Discussion

رقاقة-Seq طريقة مفيدة لتقييم موقع تفاعلات البروتين الحمض النووي العالمي (مثلاً.، عوامل النسخ/هستون تعديل التعديلات الإنزيمات/هيستون والحمض النووي) في دإط الخلايا، بينما البروتوكول Seq كاريب المطورة حديثا مفيد في استجواب الرابطة على نطاق الجينوم للكشف مع مكونات الكروماتين. رقاقة-Seq هو أ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

أيد هذا العمل وأين الدولة الجامعة، كارمانوس معهد السرطان، منحة من الوطني للقلب والرئة والدم معهد (1K22HL126842-01A1) منحت إلى B.L.K. يستخدم هذا العمل “وأين الدولة جامعة عالية الأداء الحوسبة الشبكة” للموارد الحسابية (). ونحن نشكر كوروب جيجي للمساعدة في تحليل البيانات كاريب Seq.

مساهمات المؤلفين:

B.L.K. تصور طريقة Seq كاريب وصممت ونفذت تجارب Seq رقاقة و Seq كاريب وتحليل البيانات التسلسل وصياغة المخطوط. جميع المؤلفين قد قرأت ووافقت الصيغة النهائية لهذه المخطوطة.

Materials

Mouse leukemia inhibitory factor (ESGRO LIF) EMD Millipore 106 or 107 units
GSK3β inhibitor CHIR99021 (GSK3i) Stemgent Solvent: DMSO 10mM
MEK inhibitor PD0325901 (MEKi) Stemgent Solvent: DMSO 10mM
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose Invitrogen 11965092
PBS (phosphate buffered saline) Invitrogen 10010031
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Gibco 25200056
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122
2-Mercaptoethanol (50 mM) Gibco 31350010
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Gibco 11140076
EmbryoMax ES Cell Qualified Fetal Bovine Serum, 500 ml EMD Millipore ES-009-B
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution EMD Millipore ES-006-B
Glycine Sigma G7126-500G 1.25 M stock conentration in water
Formaldehyde solution Sigma F8775-500ML
TE (Tris EDTA) pH 8.0 1X Quality Biological 351-011-131
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) solution Sigma 93482-250ML-F
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Roche 11697498001
Sodium dodecyl sulfate solution (20%) Quality Biological A611-0837-10
Q125 sonifier Qsonica 4422
Triton X-100 solution Sigma 93443-100ML
Sodium deoxycholate Sigma 30970
NaCl Sigma S7653
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation Invitrogen 10004D
Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation Invitrogen 10002D
Dynabeads Protein A/Protein G and Magnet Starter Pack Invitrogen 10015D
Lithium chloride Sigma L4408
IGEPAL CA-630 Sigma I8896
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104
Dynabeads mRNA Purification Kit (for mRNA purification from total RNA preps) Invitrogen 61006
SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit Invitrogen 11917010
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104
End-It DNA End-Repair Kit Lucigen ER81050
Klenow Fragment (3'→5' exo-) NEB M0212L
dATP (10 mM) Invitrogen 18252015
T4 DNA ligase NEB M0202L
TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder Invitrogen 10488085
E-gel EX agarose gels, 2% Invitrogen G402002
Phusion high-fidelity 2X master mix with HF buffer Thermo Fisher F531LPM
ChIPAb+ Trimethyl-Histone H3 (Lys4) – ChIP Validated Antibody EMD Millipore 17-614
Anti-Histone H3 (di methyl K4) antibody [Y47] – ChIP Grade (ab32356) Abcam ab32356
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-well) Fisher 720083
Falcon Standard Tissue Culture Dishes (10cm) Fisher 08772E
Bioruptor pico Diagenode B01010001
Qubit Flurometer 2.0 Thermo Fisher
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32851
MinElute Reaction Cleanup Kit Qiagen 28204
MinElute Gel Extraction Kit Qiagen 28604
Anti-Histone H4 (tri methyl K20) antibody – ChIP Grade (ab9053) Abcam ab9053
Labquake rotator Thermo Fisher 400110Q
Illumina HiSeq platform Illumina
TURBO DNase Invitrogen AM2238

References

  1. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
  2. Chen, X., et al. Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells. Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).
  3. Boyer, L. A., et al. Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells. Cell. 122 (6), 947-956 (2005).
  4. Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells. Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).
  5. Kidder, B. L., Hu, G., Yu, Z. X., Liu, C., Zhao, K. Extended self-renewal and accelerated reprogramming in the absence of Kdm5b. Mol Cell Biol. 33, 4793-4810 (2013).
  6. Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. KDM5B focuses H3K4 methylation near promoters and enhancers during embryonic stem cell self-renewal and differentiation. Genome Biol. 15 (2), R32 (2014).
  7. Zhao, J., et al. Genome-wide identification of polycomb-associated RNAs by RIP-seq. Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).
  8. Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
  9. Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
  10. Hudson, W. H., Ortlund, E. A. The structure, function and evolution of proteins that bind DNA and RNA. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (11), 749-760 (2014).
  11. Khalil, A. M., et al. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression. P Natl Acad Sci USA. 106 (28), 11667-11672 (2009).
  12. Hendrickson, D. G., Kelley, D. R., Tenen, D., Bernstein, B., Rinn, J. L. Widespread RNA binding by chromatin-associated proteins. Genome Biol. 17, 28 (2016).
  13. Kelley, R. L., Kuroda, M. I. Noncoding RNA genes in dosage compensation and imprinting. Cell. 103 (1), 9-12 (2000).
  14. Koziol, M. J., Rinn, J. L. RNA traffic control of chromatin complexes. Curr Opin Genet Dev. 20 (2), 142-148 (2010).
  15. Mercer, T. R., Mattick, J. S. Structure and function of long noncoding RNAs in epigenetic regulation. Nat Struct Mol Bio. 20 (3), 300-307 (2013).
  16. Chu, C., et al. Systematic discovery of Xist RNA binding proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
  17. Mak, W., et al. Reactivation of the paternal X chromosome in early mouse embryos. Science. 303 (5658), 666-669 (2004).
  18. Garfield, A. S. Derivation of primary mouse embryonic fibroblast (PMEF) cultures. Methods Mol Biol. 633, 19-27 (2010).
  19. Conner, D. A. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Curr Protoc Mol Biol. , (2001).
  20. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  21. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  22. Zang, C., et al. A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification ChIP-Seq data. Bioinformatics. 25 (15), 1952-1958 (2009).
  23. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
  24. Liu, T. Use model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS) to analyze short reads generated by sequencing protein-DNA interactions in embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 1150, 81-95 (2014).
  25. Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. ChIP-Seq: technical considerations for obtaining high-quality data. Nat Immunol. 12 (10), 918-922 (2011).
  26. Quail, M. A., et al. A large genome center’s improvements to the Illumina sequencing system. Nat Methods. 5 (12), 1005-1010 (2008).
  27. Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).

Play Video

Cite This Article
Kidder, B. L. CARIP-Seq and ChIP-Seq: Methods to Identify Chromatin-Associated RNAs and Protein-DNA Interactions in Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (135), e57481, doi:10.3791/57481 (2018).

View Video