Summary

CARIP Seq とチップ Seq: クロマチン結合 Rna および胚性幹細胞における蛋白質 DNA 相互作用を識別する方法

Published: May 25, 2018
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Summary

ここでは、チップ Seq を実行する方法について記述して ES 細胞の CARIP-Seq、次世代シーケンシング ライブラリ準備も含めて世界的なエピゲノムとクロマチン関連 RNA を生成するマップします。

Abstract

胚性幹 (ES) 細胞の自己複製と分化は細胞外シグナルと転写因子やエピジェネティックなレギュレータ叙述遺伝子に影響を及ぼすヒストンの翻訳後修飾の組み込みネットワークによって支配されます。近くの遺伝子の発現状態。RNA は、クロマチン動態と遺伝子発現を調節する様々 な蛋白質と相互作用を示されています。クロマチン関連 RNA 法 (CARIP) を次世代シーケンサー (CARIP-Seq) 続いて、次世代シーケンス (続いてクロマチン免疫沈降中のクロマチン蛋白質に関連付けられている Rna を調査する手法ChIP-Seq) ES 細胞におけるグローバル規模でのエピジェネティックな修飾子、転写因子、ヒストン翻訳後修飾の場所をマップする強力なゲノミクス手法です。ここでは、我々 は CARIP Seq とチップ Seq、次世代シーケンス、図書館建設を含む ES 細胞におけるグローバル クロマチン関連 RNA とエピゲノムのマップを生成するを実行する方法を説明します。

Introduction

胚性幹 (ES) 細胞の運命決定は、細胞外のシグナルと転写制御因子、ヒストン修飾子、およびヒストンの尾の翻訳後修飾を含むホスト間の通信によって規制されています。これらの相互作用を容易にして 2 つの状態のいずれかにクロマチンの包装: オープンと転写活性状態にあるユークロマチンと異質染色質、コンパクトで一般に transcriptionally であります。トランスクリプション要因 DNA シーケンス固有結合親和性と遺伝子発現の制御に参加するユークロマチン領域のエピジェネティックな修飾子准。チップ Seq1, を含む次世代シーケンシング方法は ES 細胞の自己複製と多能性2,3,4 の基礎ゲノムの転写ネットワークのマッピングに尽力されています。 ,5,6。さらに、RNA immunopreciation RNA 蛋白質の相互作用の次世代シーケンス (Seq-RIP)7評価が続く中 DNA 結合タンパク質が Rna 転写イベント7,を規制すると対話することを示唆します。8,9,10,11,12、いくつかの研究は、クロマチン12、または RNA およびヒストンの修正の世界的な相互作用に関連付けられている Rna のゲノムの局在を検討しました。長い非コード Rna (lncRNAs) は、クロマチン蛋白13,14,15の活動を規制する発見されている Rna の 1 つのクラスです。たとえば、Xist は、女性哺乳類細胞におけるエピジェネティックなリプレッサー16,17の募集を通じて、1 つの X 染色体の不活性化を調節する lncRNA です。しかし、クロマチンに関連付けられている Rna の完全なスペクトルはほとんど知られてないです。ここでは、新しいプロトコル、クロマチン関連 RNA 法 (CARIP) の次世代シーケンサー (CARIP-Seq)、ライブラリの準備も含めて、ES 細胞のゲノムにクロマチン結合 Rna を識別するために続いてについて述べる次世代シーケンシング、およびヒストンの修正、転写因子やエピジェネティックな修飾子のグローバル占有をマップするチップ Seq。その他 RIP Seq 方法7とは異なり CARIP Seq には、クロマチンに関連付けられている Rna の直接同定架橋と超音波処理の手順が含まれます。一緒に、チップ Seq はゲノム蛋白質 DNA の相互作用を識別するために強力なツールをクロマチンのコンポーネントに関連付けられている Rna CARIP Seq は調査する強力な方法です。

Protocol

1. 文化マウス ES 細胞フィーダー無料条件。 注: マウスの ES 細胞を細胞培養皿ゼラチンとマウス萌芽期の繊維芽細胞 (MEF) の有糸分裂活性化されているの単層コーティング (iMEFs) にメディアで培養している従来。ただし、MEF によるクロマチンと RNA の汚染を防ぐために下流のエピジェネティックなまたは式解析前に MEFs を削除必要があります。 送り装置の層の作製:…

Representative Results

私たちは正常にこのチップ Seq プロトコル6を用いた ES 細胞で KDM5B、H3K4me2、H3K4me3 ゲノムワイドなバインディングを尋問しました。ES 細胞はフィーダー無料条件 (図 1) で培養し、前述のように架橋します。超音波処理後チップ Seq プロトコルの 3.2 で説明した実行され 2% の agarose のゲル (図 2) の DNA を実行?…

Discussion

チップ Seq はグローバル蛋白質 DNA の相互作用の場所を評価するための有用な方法 (e.g、トランスクリプション要因/ヒストン/ヒストン修飾酵素と DNA の変更) ES 細胞、新開発の CARIP Seq プロトコルは便利で。クロマチンの成分と Rna のゲノム広い連合を尋問します。チップ Seq は ES 細胞のエピジェネティックな風景や他の細胞型を評価するために使用する基本的なツールです。チップ Seq ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この仕事は、ウェイン州立大学、バーバラアンカルマノスがん研究所、国立心臓、肺、血液研究所 (1K22HL126842 01A1) B.L.K. に与えられるからの助成金によって支えられました。この作品はウェイン州立大学高パフォーマンス コンピューティング グリッド計算資源の活用 ()。CARIP Seq データ分析支援ありがとうジジ ロッグマン。

著者の貢献:

B.L.K. は、CARIP Seq 法の考案し設計チップ Seq と CARIP Seq 実験を実施し、シーケンス データを分析した原稿を起草しました。すべての著者を読むし、この原稿の最終バージョンを承認しました。

Materials

Mouse leukemia inhibitory factor (ESGRO LIF) EMD Millipore 106 or 107 units
GSK3β inhibitor CHIR99021 (GSK3i) Stemgent Solvent: DMSO 10mM
MEK inhibitor PD0325901 (MEKi) Stemgent Solvent: DMSO 10mM
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose Invitrogen 11965092
PBS (phosphate buffered saline) Invitrogen 10010031
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Gibco 25200056
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122
2-Mercaptoethanol (50 mM) Gibco 31350010
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Gibco 11140076
EmbryoMax ES Cell Qualified Fetal Bovine Serum, 500 ml EMD Millipore ES-009-B
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution EMD Millipore ES-006-B
Glycine Sigma G7126-500G 1.25 M stock conentration in water
Formaldehyde solution Sigma F8775-500ML
TE (Tris EDTA) pH 8.0 1X Quality Biological 351-011-131
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) solution Sigma 93482-250ML-F
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Roche 11697498001
Sodium dodecyl sulfate solution (20%) Quality Biological A611-0837-10
Q125 sonifier Qsonica 4422
Triton X-100 solution Sigma 93443-100ML
Sodium deoxycholate Sigma 30970
NaCl Sigma S7653
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation Invitrogen 10004D
Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation Invitrogen 10002D
Dynabeads Protein A/Protein G and Magnet Starter Pack Invitrogen 10015D
Lithium chloride Sigma L4408
IGEPAL CA-630 Sigma I8896
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104
Dynabeads mRNA Purification Kit (for mRNA purification from total RNA preps) Invitrogen 61006
SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit Invitrogen 11917010
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104
End-It DNA End-Repair Kit Lucigen ER81050
Klenow Fragment (3'→5' exo-) NEB M0212L
dATP (10 mM) Invitrogen 18252015
T4 DNA ligase NEB M0202L
TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder Invitrogen 10488085
E-gel EX agarose gels, 2% Invitrogen G402002
Phusion high-fidelity 2X master mix with HF buffer Thermo Fisher F531LPM
ChIPAb+ Trimethyl-Histone H3 (Lys4) – ChIP Validated Antibody EMD Millipore 17-614
Anti-Histone H3 (di methyl K4) antibody [Y47] – ChIP Grade (ab32356) Abcam ab32356
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-well) Fisher 720083
Falcon Standard Tissue Culture Dishes (10cm) Fisher 08772E
Bioruptor pico Diagenode B01010001
Qubit Flurometer 2.0 Thermo Fisher
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32851
MinElute Reaction Cleanup Kit Qiagen 28204
MinElute Gel Extraction Kit Qiagen 28604
Anti-Histone H4 (tri methyl K20) antibody – ChIP Grade (ab9053) Abcam ab9053
Labquake rotator Thermo Fisher 400110Q
Illumina HiSeq platform Illumina
TURBO DNase Invitrogen AM2238

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Cite This Article
Kidder, B. L. CARIP-Seq and ChIP-Seq: Methods to Identify Chromatin-Associated RNAs and Protein-DNA Interactions in Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (135), e57481, doi:10.3791/57481 (2018).

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