Summary

CARIP-Seq en ChIP-Seq: methoden voor het identificeren van de chromatine-geassocieerde RNAs en eiwit-DNA interacties in embryonale stamcellen

Published: May 25, 2018
doi:

Summary

Hier beschrijven we methoden voor het uitvoeren van ChIP-Seq en CARIP-Seq, met inbegrip van de voorbereiding van de bibliotheek van next-generation sequencing, voor het genereren van wereldwijde epigenomic en chromatine-geassocieerde RNA kaarten in ES-cellen.

Abstract

Embryonale stamcellen (ES) cel zelf-vernieuwing en differentiatie wordt beheerst door Extrinsieke signalen en intrinsieke netwerken van transcriptiefactoren, epigenetische regelgevers en na vertaling wijzigingen van histonen dat combinatorisch het gen beïnvloeden staat van de expressie van genen die in de buurt. RNA is ook aangetoond dat interactie met verschillende eiwitten chromatine dynamiek en expressie van genen te reguleren. Chromatine-geassocieerde RNA immunoprecipitation (CARIP) gevolgd door sequentiebepaling van volgende-generatie (CARIP-Seq) is een nieuwe methode om RNAs gekoppeld chromatine eiwitten, terwijl de chromatine immunoprecipitation, gevolgd door sequentiebepaling van volgende-generatie (enquête ChIP-Seq) is een krachtige genomics techniek om de kaart van de locatie van de posttranslationele wijziging van histones, transcriptiefactoren en epigenetische modifiers op een wereldwijde schaal-in ES-cellen. Hier beschrijven we methoden voor het uitvoeren van CARIP-Seq en ChIP-Seq, met inbegrip van bibliotheek constructie voor de volgende generatie sequencing, voor het genereren van globale chromatine-geassocieerde RNA en epigenomic kaarten in ES-cellen.

Introduction

Embryonale stamcellen (ES) cel lot besluiten worden gereguleerd door de communicatie tussen de extracellulaire signalen en een heleboel transcriptionele-regelgevers, met inbegrip van Histon modifiers, en na vertaling wijziging van Histon staarten. Deze interacties vergemakkelijken chromatine toegankelijkheid en verpakking van de chromatine in één van twee staten: euchromatine, die is geopend en transcriptionally actief, en heterochromatin, die is compact en over het algemeen transcriptionally inactieve. Transcriptiefactoren met DNA sequentie-specifieke bindende affiniteiten en epigenetische modifiers vennoot met euchromatique regio’s te nemen bij het beheersen van de genexpressie. Volgende-generatie sequencing methoden, met inbegrip van ChIP-Seq1, zijn instrumentale in kaart brengen van genoom-brede transcriptionele netwerken die fundamenteel zijn voor ES cel zelf-vernieuwing en pluripotent2,3,4 ,5,6. Bovendien, terwijl RNA immunopreciation gevolgd door de volgende-generatie sequencing (RIP-Seq)7 evaluaties van RNA-eiwit interacties suggereren dat DNA-bindende proteïnen interactie met RNAs te reguleren transcriptionele gebeurtenissen7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12, weinig studies hebben onderzocht de genoom-brede lokalisatie van RNAs chromatine12of globale interactie tussen RNA en histone modificaties is gekoppeld. Lang niet-coderende RNAs (lncRNAs) vormen een klasse van RNAs die zijn gevonden voor het regelen van de activiteit van chromatine-geassocieerde eiwitten13,14,15. Bijvoorbeeld, is Xist een lncRNA die wordt geregeld, in vrouwelijke zoogdiercellen inactivatie van één X-chromosoom, door de aanwerving van epigenetische repressors16,17. Het volledige spectrum van RNAs gekoppeld chromatine is echter grotendeels onbekend. Hier beschrijven we een nieuw protocol, chromatine-geassocieerde RNA immunoprecipitation (CARIP) gevolgd door sequentiebepaling van de volgende generatie (CARIP-Seq), te identificeren van chromatine-geassocieerde RNAs op basis van genoom-brede in ES-cellen, met inbegrip van bibliotheek voorbereiding voor volgende-generatie sequencing en ChIP-Seq global bezetting van Histon modificaties, transcriptiefactoren en epigenetische parameters toewijzen. In tegenstelling tot andere RIP-Seq methoden7bevat CARIP-Seq crosslinking en ultrasoonapparaat stappen, waarmee voor de directe identificatie van de RNAs chromatine is gekoppeld. Samen ChIP-Seq is een krachtig hulpmiddel om te identificeren van genoom-brede eiwit-DNA interacties, terwijl CARIP-Seq is een krachtige methode om enquête RNAs chromatine onderdelen zijn gekoppeld.

Protocol

1. cultuur van muis ES cellen in Feeder-vrij voorwaarden. Opmerking: Muis ES-cellen worden conventioneel gekweekt in media op een cel cultuur schotel bedekt met gelatine en een mono-laag van muis embryonale fibroblasten (MEF), die mitotically geïnactiveerd (iMEFs). Echter, moet MEFs worden verwijderd vóór downstream epigenetische of expressie analyses om te voorkomen dat de besmetting van chromatine MEF-geassocieerde en RNA. Voorbereiding van een feeder-laag: gelatine jas van een …

Representative Results

We ondervraagd met succes de genoom-brede binding van H3K4me3, H3K4me2 en KDM5B in ES-cellen met behulp van deze ChIP-Seq protocol6. ES-cellen werden gekweekt in feeder-vrij voorwaarden (Figuur 1), en kruiselings gekoppelde zoals hierboven beschreven. Ultrasoonapparaat werd vervolgens uitgevoerd zoals beschreven in stap 3.2 van het protocol van de ChIP-Seq en geëvalueerd door het uitvoeren van DNA op een 2% agarose gel (<strong class=…

Discussion

ChIP-Seq is een handige methode om te evalueren van de locatie van globale eiwit-DNA interacties (bv., transcriptie factoren/Histon wijzigen enzymen/histone modificaties en DNA) in ES-cellen, terwijl de nieuw ontwikkelde CARIP-Seq-protocol is nuttig in genoom-brede vereniging van RNAs met chromatine kiezers te ondervragen. ChIP-Seq is een fundamenteel instrument dat wordt gebruikt ter beoordeling van de epigenetische landschappen van ES-cellen en andere celtypes. De kwaliteit van ChIP-Seq en CARIP-Seq bibliothek…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gesteund door Wayne State University, Karmanos Cancer Institute, een subsidie van de National Heart-, Long- en bloed Instituut (1K22HL126842-01A1) toegekend aan B.L.K. Dit werk gebruikt de Wayne State Universiteit hoge Performance Computing Grid voor computationele middelen (). Wij danken Jiji Kurup voor hulp bij CARIP-Seq data-analyse.

AUTEURS DE BIJDRAGEN:

B.L.K. van de CARIP-Seq-methode bedacht, ontworpen en de ChIP-Seq en CARIP-Seq experimenten uitgevoerd analyseerde de gegevens rangschikken en opgesteld van het manuscript. Alle auteurs hebben gelezen en goedgekeurd van de definitieve versie van dit manuscript.

Materials

Mouse leukemia inhibitory factor (ESGRO LIF) EMD Millipore 106 or 107 units
GSK3β inhibitor CHIR99021 (GSK3i) Stemgent Solvent: DMSO 10mM
MEK inhibitor PD0325901 (MEKi) Stemgent Solvent: DMSO 10mM
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose Invitrogen 11965092
PBS (phosphate buffered saline) Invitrogen 10010031
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Gibco 25200056
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122
2-Mercaptoethanol (50 mM) Gibco 31350010
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Gibco 11140076
EmbryoMax ES Cell Qualified Fetal Bovine Serum, 500 ml EMD Millipore ES-009-B
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution EMD Millipore ES-006-B
Glycine Sigma G7126-500G 1.25 M stock conentration in water
Formaldehyde solution Sigma F8775-500ML
TE (Tris EDTA) pH 8.0 1X Quality Biological 351-011-131
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) solution Sigma 93482-250ML-F
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Roche 11697498001
Sodium dodecyl sulfate solution (20%) Quality Biological A611-0837-10
Q125 sonifier Qsonica 4422
Triton X-100 solution Sigma 93443-100ML
Sodium deoxycholate Sigma 30970
NaCl Sigma S7653
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation Invitrogen 10004D
Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation Invitrogen 10002D
Dynabeads Protein A/Protein G and Magnet Starter Pack Invitrogen 10015D
Lithium chloride Sigma L4408
IGEPAL CA-630 Sigma I8896
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104
Dynabeads mRNA Purification Kit (for mRNA purification from total RNA preps) Invitrogen 61006
SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit Invitrogen 11917010
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104
End-It DNA End-Repair Kit Lucigen ER81050
Klenow Fragment (3'→5' exo-) NEB M0212L
dATP (10 mM) Invitrogen 18252015
T4 DNA ligase NEB M0202L
TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder Invitrogen 10488085
E-gel EX agarose gels, 2% Invitrogen G402002
Phusion high-fidelity 2X master mix with HF buffer Thermo Fisher F531LPM
ChIPAb+ Trimethyl-Histone H3 (Lys4) – ChIP Validated Antibody EMD Millipore 17-614
Anti-Histone H3 (di methyl K4) antibody [Y47] – ChIP Grade (ab32356) Abcam ab32356
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-well) Fisher 720083
Falcon Standard Tissue Culture Dishes (10cm) Fisher 08772E
Bioruptor pico Diagenode B01010001
Qubit Flurometer 2.0 Thermo Fisher
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32851
MinElute Reaction Cleanup Kit Qiagen 28204
MinElute Gel Extraction Kit Qiagen 28604
Anti-Histone H4 (tri methyl K20) antibody – ChIP Grade (ab9053) Abcam ab9053
Labquake rotator Thermo Fisher 400110Q
Illumina HiSeq platform Illumina
TURBO DNase Invitrogen AM2238

References

  1. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
  2. Chen, X., et al. Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells. Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).
  3. Boyer, L. A., et al. Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells. Cell. 122 (6), 947-956 (2005).
  4. Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells. Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).
  5. Kidder, B. L., Hu, G., Yu, Z. X., Liu, C., Zhao, K. Extended self-renewal and accelerated reprogramming in the absence of Kdm5b. Mol Cell Biol. 33, 4793-4810 (2013).
  6. Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. KDM5B focuses H3K4 methylation near promoters and enhancers during embryonic stem cell self-renewal and differentiation. Genome Biol. 15 (2), R32 (2014).
  7. Zhao, J., et al. Genome-wide identification of polycomb-associated RNAs by RIP-seq. Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).
  8. Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
  9. Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
  10. Hudson, W. H., Ortlund, E. A. The structure, function and evolution of proteins that bind DNA and RNA. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (11), 749-760 (2014).
  11. Khalil, A. M., et al. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression. P Natl Acad Sci USA. 106 (28), 11667-11672 (2009).
  12. Hendrickson, D. G., Kelley, D. R., Tenen, D., Bernstein, B., Rinn, J. L. Widespread RNA binding by chromatin-associated proteins. Genome Biol. 17, 28 (2016).
  13. Kelley, R. L., Kuroda, M. I. Noncoding RNA genes in dosage compensation and imprinting. Cell. 103 (1), 9-12 (2000).
  14. Koziol, M. J., Rinn, J. L. RNA traffic control of chromatin complexes. Curr Opin Genet Dev. 20 (2), 142-148 (2010).
  15. Mercer, T. R., Mattick, J. S. Structure and function of long noncoding RNAs in epigenetic regulation. Nat Struct Mol Bio. 20 (3), 300-307 (2013).
  16. Chu, C., et al. Systematic discovery of Xist RNA binding proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
  17. Mak, W., et al. Reactivation of the paternal X chromosome in early mouse embryos. Science. 303 (5658), 666-669 (2004).
  18. Garfield, A. S. Derivation of primary mouse embryonic fibroblast (PMEF) cultures. Methods Mol Biol. 633, 19-27 (2010).
  19. Conner, D. A. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Curr Protoc Mol Biol. , (2001).
  20. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  21. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  22. Zang, C., et al. A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification ChIP-Seq data. Bioinformatics. 25 (15), 1952-1958 (2009).
  23. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
  24. Liu, T. Use model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS) to analyze short reads generated by sequencing protein-DNA interactions in embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 1150, 81-95 (2014).
  25. Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. ChIP-Seq: technical considerations for obtaining high-quality data. Nat Immunol. 12 (10), 918-922 (2011).
  26. Quail, M. A., et al. A large genome center’s improvements to the Illumina sequencing system. Nat Methods. 5 (12), 1005-1010 (2008).
  27. Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).

Play Video

Cite This Article
Kidder, B. L. CARIP-Seq and ChIP-Seq: Methods to Identify Chromatin-Associated RNAs and Protein-DNA Interactions in Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (135), e57481, doi:10.3791/57481 (2018).

View Video