Summary

CARIP-Seq e ChIP-Seq: metodi per identificare la cromatina associata RNAs e interazioni proteina-DNA in cellule staminali embrionali

Published: May 25, 2018
doi:

Summary

Qui, descriviamo i metodi per eseguire ChIP-Seq e CARIP-Seq, compresa la preparazione di libreria per il sequenziamento di nuova generazione, per generare globale epigenomic e cromatina-associated RNA mappe in cellule ES.

Abstract

Cellule staminali embrionali (ES) auto-rinnovamento e differenziazione è regolata dai segnali estrinseci e intrinseci reti di fattori di trascrizione, regolatori epigenetici e modificazioni post-traduzionali degli istoni che combinatoriamente influenzano il gene stato di espressione di geni vicini. RNA ha anche dimostrato di interagire con diverse proteine per regolare la dinamica della cromatina ed espressione genica. Cromatina-associated RNA immunoprecipitazione (CARIP) seguite dal sequenziamento di nuova generazione (CARIP-Seq) è un nuovo metodo di indagine RNAs associato a proteine della cromatina, mentre immunoprecipitazione della cromatina seguita da sequenziamento di nuova generazione ( ChIP-Seq) è una tecnica potente genomica per mappare la posizione di modificazione post-traduzionale di istoni, fattori di trascrizione e modificatori epigenetici su una scala globale in cellule ES. Qui, descriviamo i metodi per eseguire CARIP-Seq e ChIP-Seq, tra cui la costruzione della libreria per la sequenziazione di prossima generazione, per generare mappe epigenomic e globale della cromatina-associated RNA in cellule ES.

Introduction

Le decisioni di destino delle cellule staminali embrionali (ES) sono regolate dalla comunicazione tra segnali extracellulari e una serie di regolatori trascrizionali, inclusi i modificatori dell’istone e modifica post-traduzionali degli istoni. Queste interazioni facilitano l’accessibilità della cromatina e impacchettamento della cromatina in uno dei due stati: l’eucromatina, che è aperta e trascrizionalmente attiva, e l’eterocromatina, che è compatto e generalmente trascrizionalmente inattiva. Fattori di trascrizione con affinità di legame al DNA sequenza-specifico e modificatori epigenetici associato con regioni eucromatiche di partecipare nel controllo dell’espressione genica. Metodi di sequenziamento di nuova generazione, tra cui ChIP-Seq1, sono state strumentali nella mappatura reti trascrizionali genoma che sono fondamentali per ES cella auto-rinnovamento e pluripotenza2,3,4 ,5,6. Inoltre, mentre RNA immunopreciation generazione sequenziamento (RIP-Seq)7 valutazioni delle interazioni RNA-proteina suggeriscono che proteine che legano il DNA interagiscono con RNA per regolare gli eventi trascrizionali7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12, pochi studi hanno studiato la localizzazione di genoma di RNA associati con cromatina12o interazioni globali tra modifiche di RNA e dell’istone. RNA lunghi non codificanti (lncRNAs) è una classe di RNA che sono stati trovati per regolare l’attività di proteine della cromatina associate13,14,15. Ad esempio, Xist è un lncRNA che regola, in cellule di mammifero femminile, l’inattivazione di un cromosoma di X, attraverso il reclutamento di repressori epigenetici16,17. Tuttavia, l’intero spettro degli RNA associati con cromatina è in gran parte sconosciuto. Qui, descriviamo un protocollo di romanzo, cromatina-associated RNA immunoprecipitazione (CARIP) seguita da sequenziamento di nuova generazione (CARIP-Seq), per identificare il RNAs cromatina-collegato su una base di genoma in cellule ES, compresa la biblioteca preparazione per sequenziamento di nuova generazione e ChIP-Seq per mappare occupazione globale di modificazioni istoniche, fattori di trascrizione e modificatori epigenetici. A differenza di altri metodi di RIP-Seq7, CARIP-Seq comprende fasi di reticolazione e sonicazione, che consentono l’identificazione diretta degli RNA associati della cromatina. Insieme, ChIP-Seq è un potente strumento per identificare le interazioni proteina-DNA del genoma, mentre CARIP-Seq è un potente metodo di indagine RNAs associato a componenti della cromatina.

Protocol

1. cultura di Mouse ES cellule in condizioni prive di alimentatore. Nota: Cellule di topo ES sono convenzionalmente coltivate in media su una piastra di coltura cellulare rivestita con gelatina e un mono-strato di fibroblasti embrionali del mouse (MEF), che sono stati inattivati mitotically (iMEFs). Tuttavia, MEFs dovrebbe essere rimosso prima dell’analisi epigenetiche o espressione a valle per evitare la contaminazione del MEF-collegata della cromatina e del RNA. Preparazione di uno…

Representative Results

Abbiamo interrogato con successo l’associazione genome-wide di H3K4me3, H3K4me2 e KDM5B in cellule ES utilizza questo ChIP-Seq protocollo6. Le cellule ES sono state coltivate in condizioni prive di alimentatore (Figura 1) e reticolato come descritto sopra. Sonicazione è stata successivamente eseguita come descritto al punto 3.2 del protocollo ChIP-Seq e valutata esaminando il DNA su un gel di agarosio al 2% (Figur…

Discussion

ChIP-Seq è un metodo utile per valutare la posizione delle interazioni proteina-DNA globale (ad es., fattori di trascrizione/istone modifica modifiche istoniche/enzimi e DNA) in cellule ES, mentre il protocollo di CARIP-Seq recente sviluppato è utile in interrogando associazione genome-wide di RNA con costituenti della cromatina. ChIP-Seq è uno strumento fondamentale che viene utilizzato per valutare epigenetici paesaggi delle celle di ES e altri tipi di cellule. La qualità del ChIP-Seq e librerie CARIP-Seq …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato da Wayne State University, Karmanos Cancer Institute, una borsa di studio dal National Heart, Lung e Istituto del sangue (1K22HL126842-01A1) assegnato a B.L.K. Questo lavoro utilizzata la Wayne State University alta Performance Computing Grid per risorse computazionali (). Ringraziamo Jiji Kurup per assistenza con l’analisi dei dati CARIP-Seq.

CONTRIBUTI DEGLI AUTORI:

B.L.K. concepì il metodo CARIP-Seq, progettato e realizzazione degli esperimenti di ChIP-Seq e CARIP-Seq, analizzati i dati di sequenziamento e redatto il manoscritto. Tutti gli autori hanno letto e approvato la versione finale di questo manoscritto.

Materials

Mouse leukemia inhibitory factor (ESGRO LIF) EMD Millipore 106 or 107 units
GSK3β inhibitor CHIR99021 (GSK3i) Stemgent Solvent: DMSO 10mM
MEK inhibitor PD0325901 (MEKi) Stemgent Solvent: DMSO 10mM
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose Invitrogen 11965092
PBS (phosphate buffered saline) Invitrogen 10010031
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Gibco 25200056
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122
2-Mercaptoethanol (50 mM) Gibco 31350010
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Gibco 11140076
EmbryoMax ES Cell Qualified Fetal Bovine Serum, 500 ml EMD Millipore ES-009-B
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution EMD Millipore ES-006-B
Glycine Sigma G7126-500G 1.25 M stock conentration in water
Formaldehyde solution Sigma F8775-500ML
TE (Tris EDTA) pH 8.0 1X Quality Biological 351-011-131
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) solution Sigma 93482-250ML-F
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Roche 11697498001
Sodium dodecyl sulfate solution (20%) Quality Biological A611-0837-10
Q125 sonifier Qsonica 4422
Triton X-100 solution Sigma 93443-100ML
Sodium deoxycholate Sigma 30970
NaCl Sigma S7653
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation Invitrogen 10004D
Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation Invitrogen 10002D
Dynabeads Protein A/Protein G and Magnet Starter Pack Invitrogen 10015D
Lithium chloride Sigma L4408
IGEPAL CA-630 Sigma I8896
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104
Dynabeads mRNA Purification Kit (for mRNA purification from total RNA preps) Invitrogen 61006
SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit Invitrogen 11917010
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104
End-It DNA End-Repair Kit Lucigen ER81050
Klenow Fragment (3'→5' exo-) NEB M0212L
dATP (10 mM) Invitrogen 18252015
T4 DNA ligase NEB M0202L
TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder Invitrogen 10488085
E-gel EX agarose gels, 2% Invitrogen G402002
Phusion high-fidelity 2X master mix with HF buffer Thermo Fisher F531LPM
ChIPAb+ Trimethyl-Histone H3 (Lys4) – ChIP Validated Antibody EMD Millipore 17-614
Anti-Histone H3 (di methyl K4) antibody [Y47] – ChIP Grade (ab32356) Abcam ab32356
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-well) Fisher 720083
Falcon Standard Tissue Culture Dishes (10cm) Fisher 08772E
Bioruptor pico Diagenode B01010001
Qubit Flurometer 2.0 Thermo Fisher
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32851
MinElute Reaction Cleanup Kit Qiagen 28204
MinElute Gel Extraction Kit Qiagen 28604
Anti-Histone H4 (tri methyl K20) antibody – ChIP Grade (ab9053) Abcam ab9053
Labquake rotator Thermo Fisher 400110Q
Illumina HiSeq platform Illumina
TURBO DNase Invitrogen AM2238

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Cite This Article
Kidder, B. L. CARIP-Seq and ChIP-Seq: Methods to Identify Chromatin-Associated RNAs and Protein-DNA Interactions in Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (135), e57481, doi:10.3791/57481 (2018).

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