CARIP-Seq и чип Seq: методы для идентификации связанных Chromatin РНК и ДНК белковых взаимодействий в эмбриональных стволовых клеток
Summary
Здесь мы описываем методы для выполнения чип-Seq и CARIP-Seq, включая подготовку библиотека для виртуализации нового поколения, для создания глобального epigenomic и связанные хроматина РНК карт в ES клеток.
Abstract
Эмбриональных стволовых (ES) мобильный самообновления и дифференциация регулируется внешние сигналы и внутренней сети факторов транскрипции, эпигеномные регуляторов и после перевода модификаций гистонами влияют combinatorially гена Выражение состояния близлежащих генов. Также было показано, что РНК взаимодействовать с различными белками, чтобы регулировать динамику хроматина и экспрессии генов. Хроматин связанные РНК иммунопреципитации (CARIP) следуют секвенирование нового поколения (CARIP-Seq) — роман метод обследования РНК, связывается с белками хроматина, а иммунопреципитации chromatin, следуют (секвенирование нового поколения ChIP-Seq) является мощным геномики техника для сопоставления расположения столб-поступательные изменения гистонов, факторов транскрипции и эпигеномные модификаторов в глобальном масштабе в ES клеток. Здесь мы описываем методы для выполнения CARIP-Seq и чип-Seq, включая строительство библиотеки для виртуализации нового поколения, для создания глобальных хроматина связанные РНК и epigenomic карт в ES клеток.
Introduction
Решения судьбы клетки эмбриональных стволовых (ES), регулируются связь между внеклеточных сигналов и множество transcriptional регуляторы, включая модификаторы гистонов и после перевода изменения гистона хвосты. Эти взаимодействия облегчить доступность хроматина и упаковка хроматина в одном из двух состояний: euchromatin, которая является открытой и транскрипционно активных, и гетерохроматина, который является компактным и вообще транскрипционно неактивным. Факторы транскрипции с ДНК последовательности конкретные привязки сходство и эпигеномные модификаторы ассоциированных с эухроматиновых регионов участвовать в контроле экспрессии генов. Секвенирование нового поколения методов, в том числе чип-Seq1, сыграли важную роль в картирования генома общесистемной транскрипционный анализ сетей, которые являются основополагающими для ES клеток самообновления и плюрипотентности2,3,4 ,5,6. Кроме того во время immunopreciation РНК, следуют следующего поколения виртуализации (RIP-Seq)7 оценок РНК белковых взаимодействий предположить, что протеины дна binding взаимодействуют с РНК регулировать транскрипционный анализ событий7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12, несколько исследований изучили генома всей локализации РНК, связанные с хроматином12, или глобальных взаимодействий между изменения РНК и гистонов. Один класс молекул РНК, которые были найдены регулировать активность хроматина связанных белков13,,1415длиной некодирующих РНК (lncRNAs). К примеру Xist является lncRNA, который регулирует, в женских mammalian клеток, инактивацию одной Х-хромосомы, путем набора эпигеномные подавляющего16,17. Однако полный спектр РНК, связанные с хроматином практически неизвестны. Здесь мы описываем Роман протокол, связанные хроматина РНК иммунопреципитации (CARIP) следуют секвенирование нового поколения (CARIP-Seq), чтобы идентифицировать связанные хроматина РНК в масштабах геном-ES клеток, включая подготовку библиотека для Секвенирование нового поколения и чип-Seq для сопоставления глобальные размещение изменения гистона, факторов транскрипции и эпигеномные модификаторы. В отличие от других методов RIP-Seq7CARIP-Seq включает сшивки и sonication меры, которые позволяют для прямого определения РНК, связанные с хроматином. Вместе чип-Seq является мощным инструментом для выявления генома общесистемной протеин дна взаимодействий, в то время как CARIP-Seq является мощный метод обследования РНК, связанные с компонентами хроматина.
Protocol
Representative Results
Discussion
Чип-Seq является полезным методом для оценки местоположения глобального белка ДНК взаимодействий (например., транскрипция факторы/гистона модификации ДНК и ферменты/гистона изменения) в ES клеток, в то время как недавно разработанный протокол CARIP-Seq является полезным в допрос генома …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Уэйн государственного университета, Карманос институт рака, Грант от национального сердца, легких и крови института (1K22HL126842-01A1) присуждена B.L.K. Эта работа использовали Уэйн государственного университета высокой производительности вычислительной сетки для вычислительных ресурсов (). Мы благодарим Jiji Куруп за помощь с CARIP-Seq анализа данных.
АВТОРОВ ВЗНОСОВ:
B.L.K. задуман метода CARIP-Seq, разработаны и проведены эксперименты чип-Seq и CARIP-Seq, проанализировали данные последовательности и составлен рукопись. Все авторы прочитал и одобрила окончательный вариант этой рукописи.
Materials
| Mouse leukemia inhibitory factor (ESGRO LIF) | EMD Millipore | 106 or 107 units | |
| GSK3β inhibitor CHIR99021 (GSK3i) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| MEK inhibitor PD0325901 (MEKi) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Invitrogen | 11965092 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | Invitrogen | 10010031 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Gibco | 31350010 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140076 | |
| EmbryoMax ES Cell Qualified Fetal Bovine Serum, 500 ml | EMD Millipore | ES-009-B | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | EMD Millipore | ES-006-B | |
| Glycine | Sigma | G7126-500G | 1.25 M stock conentration in water |
| Formaldehyde solution | Sigma | F8775-500ML | |
| TE (Tris EDTA) pH 8.0 1X | Quality Biological | 351-011-131 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) solution | Sigma | 93482-250ML-F | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution (20%) | Quality Biological | A611-0837-10 | |
| Q125 sonifier | Qsonica | 4422 | |
| Triton X-100 solution | Sigma | 93443-100ML | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10004D | |
| Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein A/Protein G and Magnet Starter Pack | Invitrogen | 10015D | |
| Lithium chloride | Sigma | L4408 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Dynabeads mRNA Purification Kit (for mRNA purification from total RNA preps) | Invitrogen | 61006 | |
| SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11917010 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| End-It DNA End-Repair Kit | Lucigen | ER81050 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | NEB | M0212L | |
| dATP (10 mM) | Invitrogen | 18252015 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202L | |
| TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen | 10488085 | |
| E-gel EX agarose gels, 2% | Invitrogen | G402002 | |
| Phusion high-fidelity 2X master mix with HF buffer | Thermo Fisher | F531LPM | |
| ChIPAb+ Trimethyl-Histone H3 (Lys4) – ChIP Validated Antibody | EMD Millipore | 17-614 | |
| Anti-Histone H3 (di methyl K4) antibody [Y47] – ChIP Grade (ab32356) | Abcam | ab32356 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-well) | Fisher | 720083 | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes (10cm) | Fisher | 08772E | |
| Bioruptor pico | Diagenode | B01010001 | |
| Qubit Flurometer 2.0 | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | |
| Anti-Histone H4 (tri methyl K20) antibody – ChIP Grade (ab9053) | Abcam | ab9053 | |
| Labquake rotator | Thermo Fisher | 400110Q | |
| Illumina HiSeq platform | Illumina | ||
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2238 |
References
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
- Chen, X., et al. Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells. Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).
- Boyer, L. A., et al. Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells. Cell. 122 (6), 947-956 (2005).
- Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells. Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).
- Kidder, B. L., Hu, G., Yu, Z. X., Liu, C., Zhao, K. Extended self-renewal and accelerated reprogramming in the absence of Kdm5b. Mol Cell Biol. 33, 4793-4810 (2013).
- Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. KDM5B focuses H3K4 methylation near promoters and enhancers during embryonic stem cell self-renewal and differentiation. Genome Biol. 15 (2), R32 (2014).
- Zhao, J., et al. Genome-wide identification of polycomb-associated RNAs by RIP-seq. Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
- Hudson, W. H., Ortlund, E. A. The structure, function and evolution of proteins that bind DNA and RNA. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (11), 749-760 (2014).
- Khalil, A. M., et al. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression. P Natl Acad Sci USA. 106 (28), 11667-11672 (2009).
- Hendrickson, D. G., Kelley, D. R., Tenen, D., Bernstein, B., Rinn, J. L. Widespread RNA binding by chromatin-associated proteins. Genome Biol. 17, 28 (2016).
- Kelley, R. L., Kuroda, M. I. Noncoding RNA genes in dosage compensation and imprinting. Cell. 103 (1), 9-12 (2000).
- Koziol, M. J., Rinn, J. L. RNA traffic control of chromatin complexes. Curr Opin Genet Dev. 20 (2), 142-148 (2010).
- Mercer, T. R., Mattick, J. S. Structure and function of long noncoding RNAs in epigenetic regulation. Nat Struct Mol Bio. 20 (3), 300-307 (2013).
- Chu, C., et al. Systematic discovery of Xist RNA binding proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
- Mak, W., et al. Reactivation of the paternal X chromosome in early mouse embryos. Science. 303 (5658), 666-669 (2004).
- Garfield, A. S. Derivation of primary mouse embryonic fibroblast (PMEF) cultures. Methods Mol Biol. 633, 19-27 (2010).
- Conner, D. A. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Curr Protoc Mol Biol. , (2001).
- Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Zang, C., et al. A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification ChIP-Seq data. Bioinformatics. 25 (15), 1952-1958 (2009).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Liu, T. Use model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS) to analyze short reads generated by sequencing protein-DNA interactions in embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 1150, 81-95 (2014).
- Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. ChIP-Seq: technical considerations for obtaining high-quality data. Nat Immunol. 12 (10), 918-922 (2011).
- Quail, M. A., et al. A large genome center’s improvements to the Illumina sequencing system. Nat Methods. 5 (12), 1005-1010 (2008).
- Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
